簡介
MetaPhlAn2是分析微生物群落(細菌、古菌、真核生物和病毒)組成的工具，它在宏基因組研究中非常有用，只需一條完命令即可獲得微生物的物種丰度信息(擴增子物種組成需要質控、拼接、拆樣本、切除引物、比對等步驟，此軟件居然分析宏基因組這麼方便)。同時配合自帶的腳本可進一步統計和可視化。
主頁：http://segatalab.cibio.unitn.it/tools/metaphlan2/
MetaPhlAn2可以基於宏基因組數據，獲得微生物群體中種水平精度的組成，包括細菌、古菌、真核生物和病毒。如果有株水平基因組的物種，也可以追蹤和研究。
MetaPhlAn2整理了超過17000個參考基因組，包括13500個細菌和古菌，3500個病毒和110種真核生物，彙編整理了100萬+類群特異的標記基因，可以實現：
精確的分類群分配
準確估計物種的相對丰度
種水平精度
株鑑定與追蹤
超快的分析速度
軟件 2015年發表於Nature Method，截止18年4月21日Google Scholar統計引用183次。該軟件通訊作者為意大利特蘭託大學的助理教授Nicola Segata的計算宏基因組實驗室，己發表68篇文章，發表和維護的軟件有14個，其中著名的有MetaPhlAn2, GraPhlAn, LEfSe, ShortBRED, MicroPITA, HUMAnN等。如果你對他不熟悉，那一定聽説過他的博後老闆Curtis Huttenhower(Picrust, Lefse通訊作者)。
實驗室主頁: http://segatalab.cibio.unitn.it
看看軟件主要能幹什麼
分析人類微生物組數據，微生物和樣本進行層級聚類
人類微生物組數據多時間點普氏菌屬株水平的指紋
軟件安裝
優秀的是軟件是一直在更新維護的，幾年都沒更新的軟件，如果還有更好的選擇就不建議使用。
此軟件一直在更新維護，最近一次更新是兩週前。
軟件倉庫：https://bitbucket.org/biobakery/metaphlan2/overview
依賴關係說明
軟件依賴python2.7+和numpy包，同時居然支持python3。
如果使用Bowtie2結果為輸入文件，則無任何依賴關係。
utils/metaphlan_hclust_heatmap.py腳本繪製熱圖時，依賴matplotlib包
如果想輸出biom格式結果，需要安裝R包biom
結果的進一步可視化，如使用hclust2和GraPhlAn請參考相關軟件安裝說明
下載和安裝代碼
請學習時下載安裝最新版，如下代碼僅為本文章作者學習此軟件時的版本，僅供參考。主要包括下載、解壓、添加環境變量。
<code>wget https://bitbucket.org/biobakery/metaphlan2/get/default.zip
unzip default.zip
mv biobakery-metaphlan2-5175d8783801 metaphlan2
cd metaphlan2/
export PATH=`pwd`:`pwd`/utils:$PATH
export mpa_dir=`pwd`
metaphlan2.py -v # MetaPhlAn version 2.7.6 (5 March 2018)/<code>
使用實例
定量物種譜
大家都知道擴增子分析前期處理步驟複雜，宏基因組分析應該更復雜，但此軟件卻是例外，操作簡單，一條例命令從原始數據拿到物種譜(相當於標準化後的OTU表)。是不是很牛B。
而且作者考慮了不同用戶的需求，有多種使用情況下都可用，下面多種方法根據自己的輸入文件格式任選其一。
如果輸入文件是fastq，需要依賴bowtie2安裝好
<code>metaphlan2.py metagenome.fastq --input_type fastq > profiled_metagenome.txt/<code>
推薦輸出bowtie2的比對結果，方便下次快速重新計算，並使用多線程-nproc
<code>metaphlan2.py metagenome.fastq --bowtie2out metagenome.bowtie2.bz2 --nproc 9 --input_type fastq > profiled_metagenome.txt/<code>
也可以使用bowtie2輸出文件
<code>metaphlan2.py metagenome.bowtie2.bz2 --nproc 5 --input_type bowtie2out > profiled_metagenome.txt/<code>
也可以分別進行比對和定量
<code>bowtie2 --sam-no-hd --sam-no-sq --no-unal --very-sensitive -S metagenome.sam -x ${mpa_dir}/databases/mpa_v20_m200 -U metagenome.fastq
metaphlan2.py metagenome.sam --input_type sam > profiled_metagenome.txt/<code>最常用的是使用雙端壓縮fastq文件，但並不考慮配對信息
<code>metaphlan2.py --input_type fastq profiled_metagenome.txt/<code>
最好調用多線程，並輸出比較結果
<code>metaphlan2.py --bowtie2out metagenome.bowtie2.bz2 --nproc 9 --input_type fastq profiled_metagenome1.txt/<code>
第一次使用，程序會自己下載數據庫至安裝目錄中，並進行校驗、解壓、解壓、bowtie2建索引，根據網速和服務器性能可能需要很長時間1-N小時。
輸出結果為各層級物種相對丰度值，有點像lefse的輸入文件格式(方便lefse下游差異分析)
<code>#SampleID Metaphlan2_Analysis
k__Bacteria 100.0
k__Bacteria|p__Actinobacteria 49.91104
k__Bacteria|p__Proteobacteria 46.00995
k__Bacteria|p__Firmicutes 2.45456
k__Bacteria|p__Bacteroidetes 0.99062
k__Bacteria|p__Cyanobacteria 0.63383
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria 49.91104
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Alphaproteobacteria 22.82115
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Betaproteobacteria 16.60788/<code>
多個樣品批處理
假如我們有25-28一共4個樣本，調用for循環並轉後臺並行處理
<code>cd ~/project
for i in `seq 25 28`;do
metaphlan2.py --nproc 9 --input_type fastq metaphlan2_${i}.txt &
done/<code>
個人使用上面命令處理輸入文件為壓縮格式fastq時，偶爾會出錯，幫修改為下面兩步法分別比對和生成表格，更保險
<code>for i in `seq 25 28`;do
bowtie2 -p 9 --sam-no-hd --sam-no-sq --no-unal --very-sensitive -S temp_${i}.sam -x ~/software/metaphlan2/databases/mpa_v20_m200 -U Sample_${i}.rmhost.1.fq.gz,Sample_${i}.rmhost.2.fq.gz &
done
for i in `seq 25 28`;do
metaphlan2.py temp_${i}.sam --input_type sam > metaphlan2_${i}.txt &
done/<code>
樣品物種譜合併
merge_metaphlan_tables.py命令可以將每個樣品結果表合併，程序位於程序的utils目錄中，請自行添加環境變量或使用絕對路徑。合併時支持輸入文件多個文件空格分隔，或使用通配符(如下)。可結合sed刪除樣本名中共有部分，精簡樣品名方便可視化簡潔美觀
<code>merge_metaphlan_tables.py metaphlan2*.txt | sed 's/metaphlan2_//g' > merged_metaphlan2.txt/<code>
獲得了矩陣表，下面可以進行各種統計分析與可視化啦！
<code>ID 25 26 27 28
#SampleID Metaphlan2_Analysis Metaphlan2_Analysis Metaphlan2_Analysis Metaphlan2_Analysis
k__Bacteria 100.0 100.0 100.0 100.0
k__Bacteria|p__Actinobacteria 49.91104 45.2479 54.37222 48.77918
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria 49.91104 45.2479 54.37222 48.77918
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria|o__Actinomycetales 49.53809 44.96297 54.09146 48.77918
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria|o__Actinomycetales|f__Cellulomonadaceae 0.08247 0.064 0.0 0.0
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria|o__Actinomycetales|f__Cellulomonadaceae|g__Cellulomonas 0.08247 0.064 0.0 0.0
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria|o__Actinomycetales|f__Cellulomonadaceae|g__Cellulomonas|s__Cellulomonas_unclassified 0.08247 0.064 0.0 0.0/<code>
繪製熱圖
<code>metaphlan_hclust_heatmap.py -c bbcry --top 25 --minv 0.1 -s log --in merged_metaphlan2.txt --out abundance_heatmap.pdf
metaphlan_hclust_heatmap.py -c bbcry --top 25 --minv 0.1 -s log --in merged_metaphlan2.txt --out abundance_heatmap.png/<code>
c設置顏色方案，top設置物種數量，minv最大相對丰度，s標準化方法，文件名結尾可先pdf/png/svg三種圖片格式。更多說明詳見 metaphlan_hclust_heatmap.py -h
按各樣本丰度繪製熱圖，顯示前25種高丰度菌種類，樣品默認採用bray_curtis距離聚類，微生物採用相關性距離聚類；數值採用對數10進行變換
自定義數據庫
基於bowtie2數據庫重建標記序列
<code>bowtie2-inspect ~/software/metaphlan2/databases/mpa_v20_m200 > markers.fa/<code>
追求你獲得的maker至數據庫
<code>cat new_marker.fa >> markers.fa
bowtie2-build markers.fa ~/software/metaphlan2/databases/mpa_v21_m200/<code>
並在python命令行中添加相應的物種註釋信息，詳見 https://bitbucket.org/biobakery/metaphlan2/overview#markdown-header-customizing-the-database
株水平群體基因組
此步配合StrainPhlAn軟件，分析宏基因樣本中菌株水平序列變異，輸入序列樣本，輸出MSA多序列比對文件。StrainPhlAn採用RAxML構建進化樹。
可以生成如下結果：
以HMP6個樣本為例，分析糞擬桿菌Bacteroides caccae序列在株水平的變異
有需要有朋友可按如下教程安裝相關軟件並分析 https://bitbucket.org/biobakery/metaphlan2/overview#markdown-header-metagenomic-strain-level-population-genomics
GraPhlAn圖
需要安裝好GraPhlan
<code># 基於丰度表生成graphlan文件
export2graphlan.py --skip_rows 1,2 -i merged_metaphlan2.txt --tree merged_abundance.tree.txt --annotation merged_abundance.annot.txt --most_abundant 100 --abundance_threshold 1 --least_biomarkers 10 --annotations 5,6 --external_annotations 7 --min_clade_size 1
# 繪圖
graphlan_annotate.py --annot merged_abundance.annot.txt merged_abundance.tree.txt merged_abundance.xml
graphlan.py --dpi 300 merged_abundance.xml merged_abundance.png --external_legends/<code>
建議輸出文件輸出pdf，方便後期修改文字大小和內容
採用Graphlan展示物種組成
進一步學習
可參考metaphlan2官方教程
https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/metaphlan2
分析流程
參考文獻
Duy Tin Truong, Eric Franzosa, Timothy L Tickle, Matthias Scholz, George Weingart, Edoardo Pasolli, Adrian Tett, Curtis Huttenhower, and Nicola Segata
MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling
Nature Methods 12, 902–903 (2015)
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