極端嗜酸古菌嗜酸性鐵質體的代謝和進化模式
Metabolic and evolutionary patterns in the extremely acidophilic archaeon Ferroplasma acidiphilumYT
Scientific Reports [IF 4.011]
Published online 2017 Jun 16.
doi: https://doi.org/10.1038/s41598-017-03904-5
一作兼通訊：Olga V. Golyshina
合作作者：Hai Tran, Oleg N. Reva, Sofia Lemak, Alexander F. Yakunin, Alexander Goesmann, Taras Y. Nechitaylo, Violetta LaCono, Francesco Smedile, Alexei Slesarev, David Rojo, Coral Barbas, Manuel Ferrer, Michail M. Yakimov & Peter N. Golyshin
主要單位：英國班戈大學（School of Biological Sciences, Bangor University）
導讀
Ferroplasma是極端酸性環境中極難分離培養的古菌，該研究首次獲得Ferroplasma acidiphilum的全基因組完成圖，並且通過基因組分析表明F. acidiphilumYT具有專性的蛋白分解營養型的生活方式，同時具有回補型（anaplerotic）碳同化途徑，與生理學結果一致。在實驗室培養經過550代後，該菌株的單核苷酸取代率大於1.3×10
−8，是單細胞生物中已有記錄中的最高值。摘要
鐵質體科（Ferroplasmaceae）是一種普遍存在的鐵氧化極端嗜酸菌，具有許多獨特的生理特性。作者在長期的培養實驗中基於基因組學分析了嗜酸鐵質體Ferroplasma acidiphilumYT的代謝途徑和基因組穩定性。與生理學一致，基因組分析表明F. acidiphilumYT具有專性的蛋白分解營養型的生活方式，同時具有回補型（anaplerotic）碳同化途徑。儘管在基因組中檢測出糖酵解和糖異生途徑的所有基因，包括雙功能單向果糖1,6-二磷酸醛縮酶/磷酸酶，此外，丙酮酸/2-氧戊二酸脫氫酶被原始輔酶A依賴型丙酮酸/酮戊二酸鐵氧還原酶取代。在實驗室培養經過550代後，該菌株每代每個位點的單核苷酸取代率≥1.3×10−8，是單細胞生物中已有記錄中的最高值。除了一個鹼基替換外，其餘鹼基突變均為G:C至A:T，它們在編碼區與非編碼區之間的分佈以及同義/非同義突變比表明，中性漂移是實驗室培養中基因組進化的一種普遍模式。此外，地理上相隔遙遠的
F. acidiphilum群體中顯著的基因組保守性說明自然界中的突變似乎以較低的頻率發生。背景
Ferroplasma acidiphilumYT是屬於廣古菌門（Euryarchaeota），Thermoplasmatales目，Ferroplasmaceae科的鐵氧化極端嗜酸微生物，需要少量的酵母提取物（0.02%）和較低pH值和富含金屬硫化物的環境才能培養。前人已經對美國加利福尼亞州鐵山（Iron Mountain）酸性礦山排水（acid mine drainage, AMD）生物膜的微生物群落進行了深入的宏基因組和宏蛋白組學研究，對酸性AMD生物膜的代謝和生理機制提供一些見解。早前研究還發現了F. acidiphilum有一些不尋常的生化特徵，如蛋白質組中含鐵蛋白的比例異常高、酶發揮體外活性最佳pH值較低。目前仍有必要進一步研究嗜酸菌Ferroplasma acidiphilumYT的代謝功能，特別是碳同化的主要機制，以及Ferroplasma在環境中所起的主要作用，這對其實際應用和對其生活方式的基本機制的理解方面具有重要意義。因此，從類似環境中分離出的具有特徵分離物中提取DNA，並通過測序獲得高質量基因組完成圖是一個很好的研究
Ferroplasma的機會。本文從嗜酸菌的生態位適應、營養物質獲取、能量和碳代謝途徑及其與系統發育鄰域的關係等方面對嗜酸菌進行了基因組和實驗分析。此外，作者還分析了該菌株在實驗室培養中長期維持的基因組進化模式。結果與討論
1. 基因組穩定性與進化
1.1 一般的基因組特性
嗜酸菌YT基因組大小為1,826,943 bp, G + C含量為36.49%，預計總基因數為1773個（不含19個假基因），編碼密度為86.4%；508個基因被編碼假設的蛋白質。5S、16S和23S rRNA的位點不排列在一個操縱子中，而是分散在染色體中，還預測出了46個tRNA。
1.2 F. acidiphilumYT與F. acidarmanusfer1基因組的比較
F. acidiphilum YT與F. acidarmanusfer1在其16S rRNA基因序列一致度為100%，但這並不能證明它們屬於同一物種。因此，有必要使用平均核苷酸識別（ANI）分析來評估它們之間的相關性。分析表明，ANI值中值為98.7%，遠高於基於全基因組比較的兩種物種分化的普遍閾值（95%）。除此之外,應用基因組距離計算器（GGDC 2.0）使用所有計算公式提出DNA-DNA雜交值（DDH）為73.1%、85.5%和85.80%，相應DDH值≥70%的概率為83.97%、97.3%和98.38%。這兩種分析都表明，基於基因組序列，F. acidiphilumYT和F. acidarmanusfer1屬於同一物種，儘管存在一些先前報道的生理差異。有趣的是，地理分離對這兩種生物以及許多其他生物（可以從公共序列數據庫中的宏基因組數據判斷）並沒有導致顯著的物種分化。這也可能表明，它們的地理分離發生得相對較晚。儘管這些古菌屬於一個非常特殊的生態位，但它們也必須在非酸性環境中生長，並能在非酸性環境中持久生存，這使得它們能夠定殖硫化物含量低的生態位，研究在全球範圍內傳播。可能在自然條件下，擁有如此小的基因組（因此具有一個狹窄的代謝功能庫）以及較為緩慢的代謝，使得
F. acidiphilum的進化進行速度較低，這限制了分化和物種形成。這也是符合小而緊湊的基因組的特徵，以及單拷貝核糖體RNA基因代謝成本最小化以及不需要大量的同源蛋白質的特點，以適應在非常恆定和停滯的環境條件中生長。1.3 在F. acidiphilumYT中水平轉移的基因組島
採用Seqword基因島（Genomic Island，GI）探測程序（SWGIS）、由三種不同的GI預測算法組成的IslandViewer程序包和GOHTAM工具對F. acidiphilumYT的全基因組序列進行水平轉移基因組島（GIs）鑑定。不同方法進行GI識別的聯合結果如圖1所示。SWGIS和IslandViewer程序預測出了三個較短的GIs。GOHTAM預測出許多較短區域具有非典型的四核苷酸頻率和/或密碼子使用偏好性；然而，並非所有這些區域都是基因橫向轉移起源的。預測GIs大多含有未知功能的基因、轉座酶和酶編碼基因包括編碼古菌銅藍蛋白（sulfocyanin）及相關呼吸鏈系統和beta-內酰胺酶的基因簇(126000-156681)和包含CRISPR-相關蛋白編碼基因的七號GI（905732-938099）。研究結果表明，水平基因轉移可能在嗜酸菌Y
T代謝途徑的進化和獲得抗病毒能力方面發揮重要作用。
圖1 F. acidiphilumYT的基因組和基因組島（GI）。SWGIS（粉紅色方框）、IslandViewer（藍色方框）和GOTHAM（黃色方框）預測了GIs在F. acidiphilumYT染色體上的定位。圖譜內圈的直方圖描述了以下寡核苷酸使用參數的變化：GC含量（黑色曲線；使用GC含量歸一化的四核苷酸使用模式，即計算的廣義相對方差與局部相對方差之比（藍色曲線）；未歸一化的局部四核苷酸使用模式與完整染色體計算的全局四核苷酸使用模式之間的距離（紅色曲線）；計算正向DNA鏈和互補DNA鏈的非標準化四核苷酸使用模式之間的不對稱性（綠色曲線）。綠色箭頭（外圓）表示在實驗室培養的F. acidiphilumYT基因組中，經過約550代後，基因組中存在的單核苷酸取代情況。
對數據庫中1639個細菌染色體序列中檢測到的17984個GIs進行四核苷酸模式相似性搜索。結果表明，F. acidiphilumYT的GIs與其他許多古菌和遠緣分類學單位的GIs具有顯著的成分相似性。然而，嗜酸古菌
F. acidiphilum的GIs與另一種嗜酸古菌Thermoplasma volcaniumGSS1的相似性最高。值得注意的是，在其他極端微生物GIs受體種群中有擬桿菌屬的成員。在基因組進化和基因橫向轉移中起重要作用的因子是轉座酶。基因組分析共預測出了80個轉座酶，其中28個屬於IS4家族蛋白，10個屬於MutS轉座酶突變子家族蛋白（COG3328）。早前就有研究表明，廣古菌（Euryarchaeota）中含有豐富的MutS同源基因，可能是細菌向古菌轉移基因的標誌。F. acidiphilumYT基因組中還存在其他編碼轉座酶的基因家族，包括IS605 OrfB家族和ISA0963轉座酶，IS2000家族蛋白、MULE、OrfA等，與之前的報道一致，即Thermoplasmatales目的成員通常攜帶多個IS家族。
1.4 錯配修復與重組
F. acidiphilum基因組中存在重組和錯配修復蛋白，如DNA解離酶（FAD_0665），其與產甲烷菌和細菌的對應蛋白相似性較低。DNA修復解旋酶FAD_1466與古菌Rad25蛋白相似，FAD_1503與硫化葉菌目（Sulfolobales）XPD/ rad3相關的DNA解旋酶和另一種DNA修復蛋白FAD_15
64具有30%的同源性。FAD_0550和FAD_0559基因分別編碼DNA修復和重組蛋白RadA和RadB, RecA和Rad51的同源基因，後者被認為是廣古菌特有的。錯配修復蛋白、類MutS ATP酶（FAD_0765-0766）與細菌和Thermoplasmatales目中的MutS蛋白最相似。F. acidiphilum基因組編碼的內切酶，即II型的限制性內切核酸酶FAD_0313，與細菌的同源蛋白包括內切酶III（FAD_1157, 1370）、IV（FAD_0129, 1301）和V型（FAD_0403）以及Fen1（FAD_0558）和PolX（FAD_1333）內切酶表現出高相似度。1.5 規律間隔成簇短迴文重複序列（CRISPR）
F. acidiphilumYT基因組存在兩個CRISPR，它們中間隔著一個編碼CRISPR相關蛋白（Cas）的操縱子和十個基因 （圖2）。CRISPRs和Cas蛋白代表了大多數古菌和細菌中發現的小型RNA-based干涉系統。CRISPR-Cas系統作為對噬菌體入侵的適應性微生物免疫系統，在微生物發病機制、DNA修復和生物膜等方面也發揮著重要作用。
F. acidiphilumYT的1號CRISPR相當大，包含133個相同的和3個退化的直接重複序列（30 bp），由135個類似大小的不同間隔子（34-39 bp）（圖2）。2號CRISPR較小，含有31直接重複序列（每條31bp） ，被30種不同間隔子分隔（每個35-38bp, 其中5號間隔子有62bp）。這些CRISPR簇中的間隔子和重複序列彼此之間沒有任何序列相似性，較大的CRISPR1和CRISPR2陣列可能表明F. acidiphilumYTd CRISPR系統具有較高的活性。對F. acidiphilumYTCRISPR間隔子的NCBI Blast分析顯示，在現有的病毒基因組或質粒中沒有同源序列，這表明其CR ISPR靶向病毒尚未被發現。F. acidarmanus的基因組還編碼兩個CRISPR簇和八個Cas蛋白，它們的重複序列彼此之間沒有相似性，這表明它們的CRISPR系統並不相關。F. acidiphilumYT的8個Cas基因可能與1號CRISPR簇（cas6、cas10 cas7, cas5, cas3, cas4, cas1,和cas2）共轉錄（圖2）。基於cas基因排列和cas10，F. acidiphilumYT的CRISPR-Cas系統被歸為CRISPR亞型I-D，類似於III型CRISPR系統。這與大多數古菌包含CRISPR亞型A、B或D的事實相一致。在大多數I型和III型CRISPR系統中，Cas6蛋白可以裂解長pre-CRISPR RNA （crRNA）轉錄本，生成成熟的crRNA，其中包含一個側翼有重複序列的間隔子。根據預測， I-D型CR
ISPR重複序列將形成髮夾結構，由Cas6蛋白識別並在莖環的3 ‘ -鹼基處裂解。對F. acidiphilumYT CRISPR重複序列的分析表明，它們可以形成類似的髮夾結構，這表明單F. acidiphilumYT的Cas6蛋白可以處理1號和2號CRISPR 的pre-crRNAs。F. acidiphilumYT中Cas蛋白的氨基酸序列與GenBank數據庫中的嗜酸古菌Picrophilus torridus的Cas1和Cas2蛋白序列同源性最高，分別為50%和46%。然而，F. acidiphilumYT的其他Cas蛋白與從宏基因組中組裝的Ferroplasmasp. Type II相應Cas蛋白更為相似（58%到75%的序列一致性）。 圖2 在F. acidiphilumYT中的CRISPR位點與一個編碼CRISPR相關（Cas）蛋白的操縱子（紅色箭頭）聚集在一起，其CRISPR系統屬於I-D亞型。灰色部分為10個與CRISPR無關的基因。
1.6 長期體外培養及突變分析
兩個F. acidiphilumYT變體，即1998年的原始保藏菌株DSMZ（DSM 12658T）和不斷生長在實驗室傳代（間隔為24.5天，11年）的菌株的比較基因組分析發現了116個單核苷酸替換，它們隨機分佈在染色體上（圖1,外圓上綠色箭頭）。116個單核苷酸替換中有115個是GC到AT的顛換，這種核苷酸的轉移是自發單鹼基取代突變的一種常見趨勢，這表明具有較低GC含量的F. acidiphilumYT 基因組還傾向於進一步富集AT鹼基。其中，非編碼序列中檢測到12個鹼基突變（約11%）。從編碼序列中的鹼基替換來看，103個鹼基中有34個（即33%）是同義的。69個非同義鹼基取代中，絕大多數發生非保守性氨基酸變化，只有7個發生保守性氨基酸變化，此外11個基因有兩個替代位點。編碼區域的替換主要發生在具有已知功能的基因中，也發生在17個編碼假定蛋白質的基因中（幾乎所有這些蛋白質都包含一個或多個保守域）。一些鹼基替換髮生在基因組島1、2和4，特別是GI 1，它包含編碼核糖體蛋白的基因簇。在單細胞生物範圍內計算出的每核苷酸/每位點/每一代的鹼基突變率中，F. acidiphilumYT是最高的，即相似或高於之前最高紀錄的保持者支原體Mesoplasma florum。
原核生物、病毒和大多數單細胞真核生物的鹼基替代率符合對數迴歸曲線（圖3）。然而F. acidiphilum每一代基因組的突變率為0.02，在這方面佔有突出地位，作為對比大腸桿菌的突變率大約是0.001。產生如此之高的突變率原因之一可能是F. acidiphilum YT細胞內鐵的異常丰度，這可能與氧化應激條件下Fenton反應對DNA的損傷有關。另一個可能導致高突變率的因素是易出錯的DNA聚合酶IV（FAD_1298），它誘導突變的能力以比其他聚合酶高7倍。上述假設還有待進行實驗驗證。
圖3 嗜酸菌F. acidiphilumYT在培養過程中積累的單核苷酸突變。每個位點每代的鹼基取代突變率與基因組大小的相關性。單細胞生物和病毒突變率的數據和迴歸圖（其中U和G分別為突變數和基因組大小），粉紅色區域反映出變異率的分佈與更高的點值對應於在所有550代的菌株與原來的基因組相比檢測到鹼基替換，較低的值代表比較保守。
2 能量和碳代謝
2.1 氧呼吸和鐵氧化
本文對F. acidiphilumYT的呼吸鏈進行了詳細的生化研究。有趣的是, 鐵氧化F. acidiphilumYT編碼電子傳遞鏈的基因都位於識別出的基因組島GI 1上（126000 - 156681），類似於在P. torridus和Cuniculiplasma divulgatum中的情況，它們呼吸鏈複合物的獲得也被歸因於基因橫向轉移。作者檢測到了與鐵-硫體系合成相關的半胱氨酸脫硫酶基因（FAD_0633）、共簇基因sufC和sufB基因以及與細菌sufD相似度較低的假定基因（FAD_1089-1087）。基因組中有6個ORF與鐵氧還蛋白合成相關, 其中大部分含有4Fe-4S簇，為F. acidiphilumYT的氧化還原過程提供了低電位的電子給體。
2.2 氨基酸代謝
F. acidiphilumYT組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸的合成途徑不完全，這表明F. acidiphilum需要從外部獲得這些氨基酸，這也說明F. acidiphilum是環境中的鐵氧化型的蛋白清道夫（scavengers）。F. acidiphilumYT基因組編碼氨基酸降解相關蛋白，如以尿酸鹽為中間產物降解組氨酸的基因（FAD_1379），以及以犬尿氨酸為中間產物降解色氨酸到鄰氨基苯甲酸鹽（FAD_0101-0104）和2-草酸脫氫酶複合物（FAD_1290-1291）的基因。天冬氨酸和穀氨酸通過天冬氨酸氨基轉移酶（FAD_0393、0538和1098）和穀氨酸脫氫酶（FAD_0434）通過轉胺反應生成相應的支鏈2-草酸、草酰乙酸和2-草酸戊二酸，它們都是檸檬酸循環的中間產物。從分離出嗜酸菌F. acidiphilumYT的生物浸出中試裝置中含有不同大小的礦石顆粒，該古菌可能在其中遇到缺氧的微環境。嗜酸菌F. acidiphilumYT的生理研究表明，該菌株為兼性厭氧菌，在酵母提取物上能夠化能有機營養生長，並還原鐵離子。
作者在厭氧條件下尋找與F. acidiphilumYT菌株一定代謝活性相關的基因。丙酮酸可通過鐵氧還蛋白依賴的丙酮酸氧化還原酶（POR, FAD_0567-0568）轉化為乙酰輔酶A。所得到的產物可以通過乙酰輔酶A合成酶消耗ATP轉化為乙酸酯，從而提供丙酮酸發酵的磷酸化底物。此外，F. acidiphilumYT基因組具有完成精氨酸發酵所必需的全部基因，即精氨酸脫亞酶途徑。這種原始的分解代謝途徑能夠將精氨酸轉化為鳥氨酸、二氧化碳、ATP和氨，是一些專性厭氧菌和發酵型古菌的主要能量來源。產生的氨會增加細胞內的pH值，這對原核生物適應酸性環境是十分重要的。
精氨酸脫亞胺酶通路可能存在於最後一個普遍共同祖先（LUCA）中，其基因獨立進化，經歷複雜的進化變化，最終形成一個功能相互依賴的單一基因簇。需要注意的是F. acidiphilumYT基因組中精氨酸脫亞酶途徑的三個基因，即精氨酸脫亞酶（FAD_0428）、鳥氨酸氨甲酰轉移酶（FAD_1523）和氨基甲酸激酶（FAD_0067）並不在一個操縱子中，而是在彼此相距較遠。到目前為止，還沒有在任何其他相近極端嗜酸古菌中發現上述基因。
精氨酸發酵途徑並不是古菌LUCA厭氧代謝的唯一特徵，它存在於F. acidiphilumYT基因組中。作者確定了其他幾個古老的代謝的核心，包括6個甲基轉移酶基因、5個SAM依賴型甲基轉移酶和一個鐵氧還蛋白，以及幾個H+/Na+逆向轉運型Mrp / 氫化酶相關複合物，在生物能量演化的早期階段，獲得這種可與(NiFe)氫化酶相媲美的反向轉運體被認為是一個關鍵步驟，它使地球化學pH梯度轉變為生物學上更有用的Na+梯度。值得注意的是，這些蛋白家族之前只在典型的嚴格厭氧菌中存在，很少出現在含有血紅素-銅氧還原酶的耐氧或兼性厭氧原核生物的基因組中。F. acidiphiliumYT可能是這種罕見生物的一個例子，它同時具有LUCA候選基因蛋白家族和細胞色素氧化酶。
2.3 嗜酸菌F. acidiphiliumYT中的TCA循環
大量研究發現，要成功分離許多原核生物（尤其是古菌），酵母提取物不僅是培養基中必不可少的成分，而且是眾多輔因子和營養物質包括寡肽和氨基酸的來源。這些營養物質是許多代謝途徑的基礎底物，包括三羧酸循環。這個循環可能是
F. acidiphiliumYT的代謝中心樞紐，除了2-酮戊二酸（2-OG）脫氫酶複合體其基因組中包含大部分參與三羧酸循環的蛋白（圖4）。與其他古菌相似，丙酮酸到乙酰輔酶A的轉化以及2-酮戊二酸到琥珀酰輔酶A的轉化是相應的丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶催化（POR，FAD_0567-0568）和alpha-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶（KOR，FAD_0712-0713）。儘管最初認為這兩種酶對氧極其敏感，但已在一些專性需氧的生物體中得到證實了POR和KOR活性。與厭氧酶相比，這些酶具有耐氧性、低催化速率和不尋常的亞基結構。值得注意的是，已有研究表明，為了支持生物合成反應，一些需氧原核生物可能利用KOR來將琥珀酰輔酶A羧化還原為2-OG。鑑於琥珀酰輔酶A合成酶、琥珀酸脫氫酶、延胡索酸水解酶和蘋果酸脫氫酶催化可逆反應，通過草酰乙酸經由蘋果酸、延胡索酸酯、琥珀酸和琥珀酰輔酶形成2-OG的代謝過程可能存於F. acidiphiliumYT中（圖4）。這一調查結果表明，雖然F. acidiphilium YT的碳代謝主要依賴於氨基酸分解代謝，F. acidiphiliumYT也可以完成部分還原或可逆反應。TCA循環還可以附加合成其他代謝過程的重要前體，這一策略已在許多古菌和嗜酸菌中得到證實。
圖4 F. acidiphiliumYT的三羧酸循環及相關酶反應。
儘管作者沒有量化所有參與三羧酸循環的基因的表達，琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶的轉錄分析顯示，這兩種酶表達程度相當（
圖4）。最近的蛋白質組研究表明，這些酶在Ferroplasma三價鐵還原偶聯型厭氧生長中被誘導表達。因此，很可能在這些條件下，為了給終端電子受體鐵離子（Fe3+）提供還原能力，TCA循環的分解代謝功能優於合成代謝。在沒有鐵作為電子供體的酵母提取物中，沒有檢測到F. acidiphiliumYT的生長。F. acidiphilium不能使用乙酸鹽作為唯一的碳源，對應地其基因組中鑑定不出乙醛酸酯循環的關鍵酶、異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶。2-OG可以作為氮代謝的一部分通過穀氨酸脫氫酶（FAD_0434）與氨發生同化作用直接轉化為氨基酸。此外，2-OG還可以通過生成草酰乙酸的天冬氨酸氨基轉移酶（FAD_1098）生成穀氨酸（圖4）。
2.4 糖酵解和糖異生
氨基酸的生長需要糖異生途徑來合成碳水化合物，與此同時，所有反式糖酵解途徑的基因都存在於
F. acidiphilium基因組中。有趣的是，Ferroplasma擁有一個編碼雙功能葡萄糖異生果糖1,6-二磷酸醛縮酶/磷酸酶的基因，這是一種古老的合成代謝酶。F. acidiphilium基因組中缺失典型糖酵解中的果糖1,6-二磷酸醛縮酶同系物。雖然F. acidiphiliumYT被報道不能使用糖作為唯一的碳源，但是編碼糖酵解一些本質上不可逆反應的基因如葡萄糖激酶（FAD_0277）、磷酸果糖激酶（FAD_0353）似乎存在於基因組中。此外，缺乏相應的轉運體可能阻礙了外部葡萄糖的攝取，然而F. acidiphiliumYT可以通過磷酸糖和戊糖中代謝從頭合成葡萄糖。與其他古菌的研究結果一致，F. acidiphiliumYT缺乏氧化戊糖磷酸途徑，但其還原部分完全存在且可能發揮作用（圖4）。2.5 通過基因表達分析推測F. acidiphiliumYT的CO
2同化機制有報道稱，F. acidiphiliumYT能夠將無機碳以CO2的形式加入到其生物量中。然而，基因組分析並沒有找到完整的同化途徑，而一些羧基化反應可能導致了CO2進入生物量。除了上面提到的KOR可以將琥珀酰輔酶A還原為2-OG外，POR酶也可以用於合成代謝。此外，F. acidiphiliumYT的基因組中含有兩種酶即磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）（FAD_1044）和NADH依賴型蘋果酸氧化還原酶（FAD_0703）擁有羧基化活性，可能與CO2固定有關（圖4）。採用實時熒光定量PCR技術檢測了這四種酶以及琥珀酸和蘋果酸脫氫酶基因的表達。在進行RT-PCR檢測之前，作者估計了F. acidiphiliumYT培養4天后的核酸比例，這與後期的指數增長/早期的平穩增長相對應。這個值可以指示細胞RNA水平，即代謝狀態，這與檢測的細胞數量無關。預測的RNA/DNA比值為7.81，表明
F. acidiphiliumYT細胞處於積極代謝狀態。選擇兩個組成性表達的管家基因*gyrB和rpl2作為標準，量化F. acidiphilum YT參與TCA循環和回補型CO2同化途徑轉錄本的相對丰度。與gyrB轉錄本相比，作者檢測到rpl2（大50 S核糖體亞單位的結構成分）的轉錄水平略高，這反映了F. acidiphilum YT的活躍代謝狀態。值得注意的是，與參考基因的表達水平相比較，sdhA、sdhD和mdhI的轉錄本與POR、KOR和蘋果酸酶相比的相對數量要少得多（40-200倍）。檢測到的PEPC與gyrB轉錄產物的數量相似（圖4）。RT-PCR數據證實，只有PEPC催化不可逆的羧化反應，才會促進F. acidiphilum* Y
T細胞同化無機碳。但要確認POR、KOR和蘋果酸酶對細胞總碳形成的貢獻，需要對回補反應進行更深入的生化研究。2.5 F. acidiphilumYT的轉運機制是生境特異性的
F. acidiphilumYT必須具有相應的轉運機制，才能在含有較高濃度金屬/類金屬（鐵、銅、鎘、鋅和砷）的環境中生長。在嗜酸菌YT基因組中檢測到多種基因編碼陽離子擴散促進蛋白家族（CDF）、錳/二價陽離子和碲抗性ABC轉運體。這些轉運體增強了對鎘、鈷、碲和鋅等二價金屬離子的耐受性。此外，它們也可為多種酶提供必要的輔助因子，如鉬酸鹽和鎢。F. acidiphilumY分離於於含砷豐富的環境中，為了抵抗亞砷酸鹽的脅迫，其基因組編碼依賴ATP的亞砷酸鹽外排泵。而且發現亞砷酸鹽敏感調節蛋白（FAD_1795）和亞砷酸鹽外排泵滲透酶（FAD_1796）的同源基因位於一個操縱子中。此外，染色體上距ars操縱子較遠的地方還存在編碼亞砷酸鹽外排泵ATP酶的基因（FAD_1514）。
在磷代謝方面，F. acidiphilumYT基因組具有一個鈉依賴型磷酸鹽轉運體FAD_1510和三個無機磷酸鹽:H+共轉運酶（FAD_1260,1738,1753）。在此之前，作者描述了F. acidiphilumYT在有機底物攝取方面的特異性，強調該菌株不能在如有機酸、醇和單一氨基酸、普通糖類的化合物上生長。而酵母提取物的添加對F. acidiphilum的生長至關重要，其最佳濃度為200 mg/L。與這些觀察結果一致的是，F. acidiphilumYT基因組缺乏除氨基酸外的其他常見有機化合物的轉運和同化相關的基因，只有一個完整的碳水化合物ABC轉運體（FAD_1026-1028），但至少發現7個寡肽/肽ABC轉運體和17個氨基酸轉運體。除了這些轉運蛋白外，F. acidiphilumYT基因組還含有48個轉運蛋白基因，這些轉運蛋白屬於主要促進因子超家族（MFS）。雖然還沒有證實，但這個龐大而多樣的次級轉運體群可能也參與了結構和功能上無關化合物的排出，以及包括離子、氨基酸和肽等多種底物的攝取。這些MFS相關基因與位於膜上的和轉座酶
IS4家族蛋白、氨基酸轉運體或維生素生物合成的相關基因在染色體上相鄰，說明他們的功能可能存在關聯性。F. acidiphilumYT的MFS相關蛋白與Thermoplasmatales目對應的蛋白表現出顯著的相似性。根據數據庫Thermoplasmatales目在已知廣古菌中擁有最多MFS蛋白（每個基因組平均13個）。與寡肽/肽轉運體的丰度一致，嗜酸菌F. acidiphiliumYT基因組編碼16個胞質膜相關蛋白酶和氨基酸肽酶，包括具有氨基酸肽酶活性的三角（tricorn）蛋白酶FAD_0691及其整合因子F2（FAD_0645）和F3（FAD_0317），三角蛋白酶可以依次降解寡肽，產生遊離氨基酸。除了這種複雜的蛋白水解機制外，嗜酸菌YT的基因組還編碼三種分泌型酸性蛋白酶（FAD_0679、0833和1292）。基因組分析表明，F. acidiphilumYT具有特殊的代謝能力，可以有效地將蛋白質和多肽轉化為氨基酸，這與生理學結果一致。值得注意的是，當酵母提取物濃度大於200mg/L時，F. acidiphilum YT的生長受到強烈影響，當濃度大於2g/L時，生長完全受到抑制。從基因組分析中作者可以看出，嗜酸菌YT的細胞膜上很可能含有大量的蛋白質和氨基酸轉運複合物，這些複合物決定了其獨特的分解蛋白類營養物質的能力。但大量營養物質突然進入細胞質，可能會破壞呼吸鏈的代謝平衡，產生有害活性氧分子，如羥基自由基和過氧化物。此外，F. acidiphilumYT細胞質會被有機化合物充滿，導致細胞脫水死亡。綜上所述，這些結果表明F. acidiphiliumYT古菌是一種專性的蛋白降解營養型以及化能混合營養型古菌。
F. acidiphiliumYT的基因組中不存在已知的CO2固定途徑，這表明F. acidiphiliumYT同化無機碳的能力可能是回補型CO
2同化的結果。值得一提的是嗜酸桿菌的普遍性和它們基因組的顯著保守性。鐵的氧化能力是迄今為止所培養和研究的Thermoplasmatales目古菌成員獨有的特徵，這代表了一定的優勢以及生態位中的物種特徵，可能與這些古菌的廣泛分佈有關。這與迄今為止只在日本島嶼上發現的Picrophilus屬或Thermogymnomonas屬形成了鮮明對比。另外一個有趣的發現是，在實驗室培養約550代後，F. acidiphilumYT的基因組中出現了相對較多的單核苷酸取代。作者假設，造成如此高的突變率的原因可能是在最佳的培養條件下F. acidiphilumYT生長速度更快，這對於這些古菌來說是非典型的，因為它們在自然棲息地的真實生活中往往表現出顯著的基因組保守性，即使在地理位置遙遠的種群中也是如此。核苷酸取代分析表明，F. acidiphilumYT的基因組傾向於進一步降低GC含量。同義氨基酸取代與非同義氨基酸取代的比值以及編碼區與非編碼區之間單核苷酸取代的分佈表明，在最優的培養條件下，中性漂移是
F. acidiphilumYT基因組進化的普遍模式。這一假設的驗證還需要對在連續生物反應器中運行的平行細胞系進行更深入的實驗分析，以及更多的代時的基因組進行分析。方法
1 參考菌株和生長條件
F. acidiphilumYT（DSM 12658T）於1998年保存於DSMZ，並於2008年對DSMZ中原始分離株進行基因組測序。F. acidiphilumYT在含有25g/L FeSO4.7H2O以及0.02%（w/vol）酵母提取物。為了計算單代突變率，自1998年該菌株存放到DSMZ菌株培養庫後，在最優條件下，在100mL Erlenmeyer燒瓶中培養。每次接種10mL，重複生長實驗164次。對最終培養物（2008）進行DNA提取測序。利用基因組DNA提取試劑盒對兩種突變體進行DNA分離提取。
2 測序和組裝
F. acidiphilum YT的從頭測序是在利物浦大學基因組中心的454 FLX Ti（布蘭福德，美國）上使用標準庫（34x覆蓋率）進行的。基因組組裝和Gap的閉合由公司Fidelity Systems Ltd.（美國馬里蘭州蓋瑟斯堡市）使用Phred/Phrap以及Consed完成，操作完成最終的序列組裝。DupFinisher用於糾正重複的錯誤裝配，384個Sanger端序列fosmids用於生成scaffold （覆蓋率為0.98 x）。基因組在Fidelity Systems公司（USA）使用Fgenesb:2.0自動註釋，並使用GenDB v. 2.2.1註釋系統手動整理。核糖體RNA基因通過BLAST比對公共核苷酸數據庫進行識別，使用tRNAScan-SE v. 1.2163識別tRNA基因。CRISPRFinder 在線服務器用於標識CRISPRs。利用Illumina（平均覆蓋面積233）對實驗室培養約550代嗜酸菌YT變異株的基因組進行測序，並將測序結果與組裝型菌株基因組進行比對。將嗜酸菌YT的基因組序列存入GenBank/EMBL/DDBJ數據庫，登錄號為CP015363。
3 RNA分離與定量逆轉錄PCR分析（Q-RT-PCR）
採用Q-RT-PCR方法對10個靶基因轉錄本的丰度進行估計。F. acidiphilumYT細胞培養4天后（從對應靜止期相開始），將15-25 mL培養物在9000 rpm下離心15 min，用miRVANA kit （Ambion）快速純化總RNA。RNA樣品採用Turbo去DNA試劑盒（Ambion Austin, TX, USA）處理。為了消除RNA製劑中殘留的DNA汙染，在互補DNA（cDNA）生產之前，加入第二次DNA酶進行處理（DNase I, Invitrogen）。cDNA合成採用上標II逆轉錄酶（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA），總RNA為100ng，使用隨機六聚體引物（Thermo F
isher Scientific）2 pmol，按照說明書進行。所有RT-PCR實驗均使用ABI 7500快速實時PCR系統進行循環反應。採用Primer Express軟件v2.0（Applied Biosystems, USA）設計基因特異性引物和TaqMan探針。RNA樣品與對照同時進行三次檢測。反應條件為：50℃反應2 min, 95℃反應10 min, 95℃反應15 s循環40次，60℃反應1 min。通過檢測PCR產物的溫度依賴性熔融曲線和克隆擴增子測序，檢測PCR特異性和產物量。基於放大產生的熒光達到特定檢測閾值（Ct值）所需要的週期數生成RT-PCR定量數據。RT-PCR擴增採用自動設置基線和閾值以及相對標準曲線法進行分析。所有放大的標準都是基於已知數量的克隆目標模板。通過從基因組DNAPCR擴增目標基因產生擴增子。然後使用Wizard SV凝膠和PCR淨化系統試劑盒（Promega, Madison, WI, USA）純化得到的擴增子，並在pGEM-T Easy Vector System I（Promega）中克隆。使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒（Qiagen, Hilden, Germany）提取質粒，使用Nanodroprd-1000分光光度計測定DNA濃度。標準曲線基於107~101個基因拷貝的序列的梯度稀釋。然後用軟件自動生成Ct值，計算三次的平均Ct值和標準差（SD）值。
譯者簡介
黎亮志，18級生物工程碩士，中南大學資源加工與生物工程學院本碩，研究方向為環境微生物組學，目前主攻極端嗜酸微生物的基因組學研究，曾在微生物學國際學術期刊《
Applied and environmental microbiology》發表一作論文。歡迎批評、指正和交流。郵箱：[email protected].cn原文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5473848/?report=classic
Olga V. Golyshina, Hai Tran, Oleg N. Reva, Sofia Lemak, Alexander F. Yakunin, Alexander Goesmann, Taras Y. Nechitaylo, Violetta LaCono, Francesco Smedile, Alexei Slesarev, David Rojo, Coral Barbas, Manuel Ferrer, Michail M. Yakimov & Peter N. Golyshin. Metabolic and evolutionary patterns in the extremely acidophilic archaeon Ferroplasma acidiphilum YT. Scientific Reports. 2017, 7: 3682. doi:10.1038/s41598-017-03904-5
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