如果說良好的開始是成功的一半，那麼，對微生物組研究而言，這個開始就是樣本的收集。如果選擇錯了樣本收集或保存方法，可能不僅僅意味著錯過了關鍵的線索，還有可能產生與事實相反的結果。
那麼，微生物樣本收集和保存過程究竟需要考慮哪些因素呢？不同的方法會對你的研究和後續的實驗造成什麼影響呢？
今天我們特別編譯了加利福尼亞大學聖迭戈分校（UCSD）兩位學者發表的關於糞便樣品採集和保存的文章。希望該文能夠為研究人員和各位讀者在微生物樣本的收集上提供一些指導和幫助。
糞便樣品的“穩定性”
簡便且安全地收集人體糞便樣品是研究人體微生物組方面的關鍵。雖然在實驗設計中，研究人員所做的重要的決定之一是選擇準確的設備試劑，然而由於資金的問題，設備試劑選擇時需要考慮的因素很容易被我們忽視。
不幸的是，目前並不存在一種收集方法，可以適合全球不同研究的限制，並滿足所有實驗室要進行的不同實驗的要求。
對於設備試劑的選擇，比如化學藥品的使用、樣本的收集方式、甚至使用的塑料種類都可以引起偏差，同時也會限制和影響樣本後續的分子生物學實驗。
許多的分子生物學實驗的黃金標準是在採集樣品後儘快速凍，最好是保存在 -80℃。儘管這一方法在臨床研究中是理想且可行的，但是在許多研究中，由於冰櫃使用、運費成本和物流的限制，這種方法在實際實施過程中會有一定的困難。
想象一下，攜帶液氮到印度尼西亞的遙遠村落中帶來的不便，或者實驗參與者在家中收集樣本並正確地將樣品放置於乾冰過夜直至送到實驗室中所產生的成本。
因此，許多糞便微生物組研究聚焦於是否存在一種方案，可以使樣品在室溫下長時間穩定存放。
不過，樣品“穩定性”的定義會因實驗設計和探究問題的不同而不同。
舉例來說，研究人員研究糞便的代謝組學時擔心的問題是，在樣品中發現的小分子是否還是樣品收集時的分子分佈，並且不需要去擔心 RNA 的降解問題。
相反，研究細菌和古菌分類學組成的科研人員，所擔心的是基因組 DNA 組成是否反映了樣品收集時的情況，而不會關心使用塑料是否會帶來小分子汙染。
乾溼保存法：有何要注意？
一個收集設備至少應該包含兩部分，一是獲得樣品的方式，二是能夠提供安全運送的方式。
保持一個樣品穩定的方法，通常是在收集樣品的設備（比如拭子）上預先添加保護劑，或者將保護劑作為樣品容器的一部分（比如在試管中的 95%乙醇）。
化學保護劑用來抑制特定的生化反應，或者裂解並殺死細胞，或者阻止微生物樣品的生長。但是使用化學保護劑的成本較高，所以一些設備會額外採用一些小珠子，提供一種在劇烈搖動時破碎細胞的物理方法，可以實現“在現場”就能夠保存基因組 DNA。
廣義來講，樣品保存主要分為兩個大類：幹保存法和溼保存法。
（1）溼保存法是將糞便生物質懸浮於水溶液中。這種方法對細胞、核酸、氨基酸和小分子的影響取決於在溶液中所用到的化學成分。
市售的溶劑，包括 RNALater 和 OMNIgene 是特別為固定樣品中的 RNA 或者 DNA 所設計的，這種溶劑中的化學成分可以阻斷使核酸降解的細胞進程和酶的生化反應。
如果使用普通 95%的乙醇會破壞細胞壁，導致樣品中很大一部分的細胞裂解，導致細胞死亡，從而影響轉錄組的數據結果，影響差異表達基因的結果。
（2）幹保存法是使用棉籤或者硬紙板，在其表面可能含有使細胞裂解並固定核酸的粉末。通常，在幹保存法中使用的化學成分在設計時就應該考慮到其特定的目標，比如阻斷細胞複製。
比如 American Gut 項目，使用一種不含有任何保護劑的幹拭子，通過乾燥樣品使微生物停止生長。但是，當實驗人員在拭子中添加過多的樣品時，造成溼度的增加可能引起運輸過程中細菌生長，並破壞信號。
因此，不含有保護劑的乾性拭子或者硬紙板必須儘快在冷凍或速凍的條件下運送，最好還能維持一個低溼度的環境。
總之，所有的這些保存方法（使用或不使用保護劑）都會對微生物細胞造成不同的干擾。這些差異通過許多方式呈現，比如：細胞對緩衝液中細胞裂解物質敏感性的不同，細胞周圍物質的變化對保存效果的影響也不同等等。
重要的是，這些不同會導致在樣品的最終結果呈現中造成一定的技術偏差，甚至使用的一些化學成分可能會阻礙後續的分子生物學實驗。比如，高鹽保護劑可能不適用於質譜研究設備中，因為其可能會干擾設備對小分子物質和肽類物質的檢測。
收集獲得樣品的方法
不管使用什麼保存方法，物理收集或獲得樣品都是必須要考慮的一個重要環節。
對生物量要求較大的研究中，比如用於蛋白質組研究的，可以使用醫療便桶。這種放置在馬桶圈內的設備，類似一種塑料管，可以收集全部的糞便。在一些情況下，醫療便桶配備一個小勺子，並會提示實驗參與者將糞便從便桶收集到一個可能包含保護劑的小瓶中。
可以理解的是，由於需要對糞便進行直接處理，導致發生一些不愉快的經歷，可能會把一些實驗參與者拒之門外。
如果對生物量的要求較低，比如對擴增子和宏基因組的研究中，其下游步驟僅需要皮克或者納克的 DNA 量，通常使用的收集設備是棉籤拭子。
收集方法是用棉籤擦拭使用過的廁紙，使棉籤變色即可。接著將棉籤放回試管中，或者可以將其折斷到試管中。這些試管可能有也可能沒有保護劑。
像使用便桶一樣，這種方法可能對實驗參與者來說也是一種不舒服的經歷。但是相比於需要與糞便進行更多接觸的勺子採集方法，實驗參與者可能更傾向於採用廁紙收集的方法。
保護劑誰更強？
研究人員需要做的進一步的考慮是有關保護劑毒性的問題。保護劑具有較高的毒性是很正常的。畢竟這些試劑的目的是阻斷在人體中所發現的分子生物進程。在使用時一定要注意人類和動物的意外中毒。
儘管大部分的化學物質可能是有毒的，但也不全是，比如 95%的乙醇，可以基本認為是安全的，雖然在使用中仍然需要遠離小孩和寵物。
另外，還要考慮到保護劑的成本和適用性。
一項由 Rob Knight 團隊發表在 mSystems的研究測試了 5 種保存劑保存人和狗的糞便樣本 DNA 的效果，具體為：乙醇（濃度分別為 70%和 95%）和三種市售試劑——RNAlater，OMNIgene Gut（DNA Genotek）和 FAT Card（Whatman）1。
並將每個樣本暴露於各種溫度環境，包括 -20℃，-4℃ 的恆定溫度和環境溫度，以及模擬凍融循環和週期性熱梯度的溫度波動（從 4 ℃ 到 40 ℃）。
結果發現，即使最糟糕的方法，包括那些沒有保護劑的方法，依然能夠在8周時揭示物種之間以及 1 周後個體之間微生物組的差異。
研究還發現 FAT Card 引起的差異是系統性的，可以消除。同時與其它研究一樣，建議不要使用 70%的乙醇。
另一項研究評估了保存劑在代謝組方面的效果2。結果發現，對於非靶向代謝組學，95%的乙醇效果最好，其次為 FAT Card 和 OMNIgene Gut。
不同的保存劑的效果總結如下：
表1：不同保存劑的成本和適用性
【注：除 OMNIgene Gut 外，大部分產品的價格來自於 fishersci.com網站。對 OMNIgene Gut 成本的估算來源於同行評審的研究。
a：適用於 2ml 的 DNA 樣品且不包括收集設備。
b：不包括收集設備。
c：保存劑對 DNA 的適用性結果基於同行評審。
d：RNALater 是唯一已知的用於固定 RNA 的保存劑。
e：保存劑對代謝組的適用性結果基於同行評審。】
如何選擇：簡單一些？
當考慮到實驗中的糞便收集時，最重要的是理解糞便的收集方式、保存方法、運輸方法和這些方法導致的對下游分析的影響。
不是所有的設備試劑帶來的差異都是相同的，這些差異表現在單位成本、與其他研究比較時的技術偏差、實驗限制和與目標人群的兼容性等方面。
針對不同目的的實驗，可能會存在不止一種最佳方案，因此在進行任何實驗之前，需要與糞便微生物專家進行討論。
當存在問題時，採用已有研究中的設備試劑和方案是一種合理的策略，因為在這些研究中已經做了一系列比較去減小技術差異。並且就像在科學或者其他領域中那樣，寧可簡單一些才是合理的策略，尤其是對大型流行病調查而言。
參考文獻：
1.Song, Se Jin, et al."Preservation methods differ in fecal microbiome stability, affectingsuitability for field studies." MSystems 1.3 (2016).
2.Wang, Zheng, et al."Comparison of fecal collection methods for microbiome and metabolomicsstudies." Frontiers in cellular and infection microbiology 8(2018): 301.
原文鏈接：
3.https://www.biotechniques.com/clinical-research/fecal-sample-collection-for-clinical-microbiome-research/
作者｜Daniel McDonald、Jack Gilbert
翻譯｜gemiu
審校｜617
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