肝细胞肝癌的免疫治疗进展

作者：邓康健1，谢兴旺2，王雪艳2，陈冬波2，陈红松2，廖维甲1，袁晟光3

单位：1.桂林医学院附属医院肝胆外科实验室；2.北京大学人民医院北京大学肝病研究所丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室；3.桂林医学院第二附属医院肝胆胰外科

2018年全球癌症统计数据显示，原发性肝癌新发病例达841 080例，占所有恶性肿瘤新发病例的4.7%，排第6位，死亡病例781 631例，占当年所有恶性肿瘤死亡病例的8.2%，排第4位。而中国的形势更为严重，据中国国家癌症登记中心统计，2014年我国原发性肝癌新发病例为36.5万，发病率为26.67/100 000，居第4位，死亡病例为31.9万，死亡率为23.31/100 000，居第2位。在原发性肝癌中，最主要的病理类型为肝细胞肝癌(HCC)，约占原发性肝癌的90%。与美国和英国相比，中国癌症发生率较低，但癌症死亡率较高，其中包括HCC在内的消化系统癌症占癌症相关死亡的36.4%，而且预后相对较差。乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒HCV)持续感染是HCC的主要病因，黄曲霉毒素暴露也是重要的危险因素，此外，大量饮酒、吸烟、肥胖、家族/遗传因素、饮食习惯与HCC的发生发展也有关。在中国，HCC同样主要由慢性感染引起，如HBV感染。近年来，随着科学技术的不断发展，HCC的治疗手段也在不断更新。除了传统的肝切除术、化疗、放疗、肝移植、经导管动脉化疗栓塞、消融等治疗外，靶向治疗如索拉非尼、仑伐替尼、瑞格非尼也逐步应用于临床，并可提高晚期HCC患者的生存率，但晚期HCC的治疗仍缺乏很有效的方法。免疫疗法的出现给HCC的治疗提供了新的选择，其中的免疫检查点抑制剂已成为晚期HCC患者潜在的有效治疗手段；嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、T细胞受体基因工程改造的T细胞(TCR-T)、新生抗原疫苗和溶瘤病毒等新兴的免疫治疗技术也逐步往临床应用上推进。综观肿瘤的免疫治疗发展史，早期的治疗主要是通过各种策略活化扩增体内的T细胞，或者在体外扩增T细胞之后回输到体内进行治疗。无论何种方式，均以T细胞作为抗肿瘤的核心。随着对免疫系统的认识逐步加深，自然杀伤细胞(NK细胞)、固有免疫系统和免疫微环境在抗肿瘤免疫中的作用逐渐得到重视，并衍生出一系列不依赖T细胞功能的抗肿瘤免疫疗法。现从以T细胞为核心的免疫治疗方法以及非T细胞的免疫治疗方法两个角度对HCC的免疫治疗进展进行综述。

1.1 细胞因子介导T细胞的非特异性活化扩增

白细胞介素(IL)2是抗原刺激后活化T细胞分泌的一种多效性细胞因子，能够刺激T细胞的增殖并增强杀伤活性，在T细胞免疫应答中发挥关键作用。19世纪80年代，重组IL-2的出现使得IL-2用于临床抗肿瘤治疗成为可能。IL-2单独使用或者联合应用的临床试验，在黑色素瘤等肿瘤治疗中取得一定效果。近年来，IL-2已应用于治疗HCC，Bertelli等发现，不能手术的HCC患者，经IL-2治疗后，患者的生存率得到提高。Palmieri等发现，采用超低剂量的IL-2(1 MIU/d)(1 000 MIU=1 IU)治疗，能够一定程度控制HCC的进展。但是，直接使用IL-2进行抗肿瘤治疗会产生严重的不良反应，患者能够耐受的全身用药剂量有限，因此并未取得显著疗效。

近来的部分临床前研究还发现，其他IL如IL-15、IL-18等也具有直接活化T细胞并介导抗HCC的作用，但是临床疗效尚未证实。

1.2 治疗性肿瘤疫苗介导T细胞的特异性活化扩增

由于IL-2等细胞因子非特异性活化T细胞具有局限性，采用特定肿瘤抗原作为治疗性肿瘤疫苗，通过主动免疫扩增肿瘤特异性T细胞克隆的方法更有优势。治疗性肿瘤疫苗是指将肿瘤抗原以多种形式导入患者体内，以激活患者自身免疫系统，识别和杀伤肿瘤，从而控制或清除肿瘤。用于制备疫苗的肿瘤抗原主要包括肿瘤相关抗原和肿瘤新生抗原两种。肿瘤相关抗原并非肿瘤细胞所特有，是指在肿瘤中异常高表达，但也少量存在于正常细胞的抗原。最主要的肿瘤相关抗原类型为癌-睾丸抗原，这类抗原在肿瘤细胞和睾丸细胞中均有表达，而在除睾丸、胎盘外的正常组织中均不表达，如黑色素瘤抗原基因-A1、黑色素瘤抗原基因-A3和纽约食管鳞状上皮癌抗原1等。由于睾丸不表达人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类和Ⅱ类分子，所以睾丸细胞中的癌-睾丸抗原不能被T细胞识别，因此癌-睾丸抗原在免疫学上可考虑为具有肿瘤特异性。但是，这些抗原仍属于自身成分，自身的T细胞在胸腺发育过程中已经建立肿瘤相关抗原的“中枢免疫耐受”，因此免疫细胞对肿瘤相关抗原的识别和反应能力有限。根据2015年的一项meta分析，单一的肿瘤相关抗原疫苗治疗并不能对HCC患者产生显著的临床效果。

一项关于甲胎蛋白(AFP)治疗性肿瘤疫苗的Ⅰ期临床试验前瞻性研究，对15例HCC患者皮下注射AFP衍生肽(AFP357和AFP403)发现，15例患者均未发生严重不良反应，其中4例患者检测到AFP357特异性CD8+T细胞，1例患者完全缓解。提示，如果免疫表位选择得当，肿瘤相关抗原疫苗也可能产生显著的临床疗效。而有研究显示，基于肿瘤新生抗原的治疗性疫苗能有效阻止肿瘤进展。肿瘤新生抗原是指肿瘤中的基因突变而编码出的新的未知蛋白质或多肽。肿瘤新生抗原不但具有良好的肿瘤特异性，还具有更高的异质性，更容易被机体的免疫系统识别。上述概念在对黑色素瘤患者的治疗中得到了很好的验证，对HCC的新抗原疫苗甚至是个体化疫苗的研发有很好的指导作用。但是，新抗原疫苗治疗HCC能否取得显著的疗效，需要更多的临床试验给予支撑。

1.3 外源性补给非特异T细胞

无论是细胞因子刺激还是肿瘤疫苗的主动免疫，均在患者的体内直接活化和扩增T细胞；而过继细胞治疗则是在体外扩增T细胞之后，再回输到患者体内。过继细胞治疗通过具有抗肿瘤活性的自然宿主细胞，或用CAR、TCR进行基因改造的宿主细胞，成功介导了多种肿瘤的显著消退，包括黑色素瘤、宫颈癌、淋巴瘤、白血病、胆管癌和神经母细胞瘤。早在1988年，美国国家癌症研究所的Rosenberg等就尝试将IL-2激活扩增后的淋巴因子激活的杀伤细胞回输至患者体内，杀伤肿瘤细胞，随后又出现了细胞因子诱导的杀伤细胞和树突状细胞活化的细胞因子诱导的杀伤细胞。细胞因子诱导的杀伤细胞是一种非特异外源性补给T细胞的细胞疗法，含有由细胞因子(γ干扰素、IL-1及IL-2)和抗CD3抗体在体外培养的外周血单个核细胞中刺激产生的异质性CD8+效应T细胞群体。这种细胞治疗已得到广泛研究，并应用于包括HCC在内的癌症患者的治疗。一项荟萃分析共纳入了8个研究，与未经免疫治疗的对照组(912例)相比，HCC细胞免疫治疗组(949例)的患者生存获益显著，其中1年、3年和5年的无复发生存率和总生存率均得到改善。

1.4 外源性补给特异T细胞

回输至患者体内的细胞因子诱导的杀伤细胞因缺乏对肿瘤细胞的特异性，杀伤效果较弱，虽能使患者一定程度获益，但是疗效相对有限。而肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)多具有肿瘤特异性，因此从TIL中扩增T细胞并回输，相较于从外周血单个核细胞中扩增T细胞而言，所获得T细胞克隆的肿瘤特异性更好。Rosenberg和Dudley从癌症患者的肿瘤组织中提取了TIL，经体外扩增培养后回输到患者体内，治疗转移性黑色素瘤，应答率高达50%。但是TIL疗法有很多限制，只有对于类似黑色素瘤这种结构松散、容易分离提取免疫细胞的肿瘤组织，才能方便获取TIL进行体外扩增。HCC患者中，由于肝硬化等因素导致肿瘤组织质地坚硬，从肿瘤中分离和扩增培养TIL的难度很高。另外，如果肿瘤组织中的TIL数量过少，或者活力较差，均使得基于TIL的治疗方式无法实施。因此TIL疗法一直未能获得广泛应用，而CAR-T和TCR-T治疗技术因为能够克服上述的局限性而逐渐得以推广。

CAR-T和TCR-T技术的共同之处在于通过基因改造的手段实现T细胞受体对特异性癌症细胞抗原的识别能力和攻击能力，因此统称为T细胞受体重新定向技术。CAR由细胞外结合域、铰链区、跨膜域和一个或多个细胞内信号域组成，其中细胞外结合域主要来源于肿瘤抗原反应性抗体的单链可变片段，而细胞内信号域通常包括CD28和(或)4-1BB。截至2018年3月，全球正在进行的753项抗肿瘤细胞治疗开发中，404项研究为CAR-T细胞疗法，其中的73项研究以CD19作为CAR-T细胞的靶点。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3定位于细胞膜表面，在HCC中的表达水平显著增高，已成为HCC治疗的一个CAR-T靶点。根据2017年美国临床肿瘤协会年会公布的Ⅰ期临床试验数据，13例接受磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 CAR-T细胞治疗的HCC患者，有2例患者实现了3年无瘤生存，这为之后的以磷脂酰肌醇蛋白聚糖3为靶点的CAR-T治疗HCC的临床试验提供了依据。与CAR不同的是，TCR可识别主要组织相容性复合体分子递呈的抗原多肽，并介导T细胞的活化和免疫反应。近年来，基于TCR的细胞疗法TCR-T逐渐受到重视。在黑色素瘤、滑膜肉瘤和多发性骨髓瘤中，基于TCR-T治疗的客观缓解率(ORR)高达50%～80%。在HCC中，也有靶向HBV抗原和AFP的TCR-T的相关临床研究正在进行。在因HBV相关HCC接受肝移植的患者中，HBV抗原在HCC转移或者复发病灶中(但不在供体肝脏)表达，利用表达HBV抗原特异性TCR的T细胞，能够有效控制肝移植术后HCC的转移病灶和HBV的再次感染。另外，Adaptimmune公司针对HCC中高频率表达AFP的特点，开发了一个高亲和力的治疗性TCRAFP 332 T，目前正在开展Ⅰ期临床试验，也是一项有前景的治疗选择。

1.5 免疫检查点抑制剂恢复T细胞杀伤活性

近年来，人们发现了抗肿瘤免疫应答中的抑制性检查点，最引人关注的是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。肿瘤细胞中PD-L1表达水平上调是肿瘤限制宿主免疫攻击的关键机制，通过结合肿瘤特异性CD8+T细胞上的受体PD-1，可以抑制T细胞的杀伤功能。若能够阻断HCC细胞表面的抑制性配体与T细胞表面的抑制性受体结合，就可以逆转T细胞的耗竭功能，恢复免疫识别和免疫攻击，从而增强抗肿瘤免疫反应。在黑色素瘤、肺癌、淋巴瘤等部分晚期癌症中，免疫检查点抑制剂已成为目前最有效的治疗方法。以非小细胞肺癌为例，PD-1/PD-L1单抗治疗使得晚期非小细胞肺癌患者的5年生存率由过去的不到5%提高到了16%，大大提高了肿瘤患者的生存预期。目前美国食品药品管理局批准上市销售的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4单抗有伊匹单抗，PD-1/PD-L1单抗有纳武单抗、帕博利珠单抗、阿特珠单抗、Avelumab、度伐鲁单抗；中国国家食品药品监督管理总局批准上市销售的单抗除了纳武单抗、帕博利珠单抗外，还有特瑞普利单抗和信迪利单抗。目前，已在晚期HCC领域进行了多项免疫检查点抑制剂临床试验探索，HCC中单一PD-1/PD-L1抗体的ORR达10%～20%，为PD-1抑制剂纳入晚期HCC治疗指南，并推荐作为二线治疗提供了有力依据。其中，最先开展并完成的CheckMate 040研究发挥了至关重要的作用，该研究的结果显示:未接受索拉非尼治疗的初治患者，使用纳武单抗治疗后ORR在20%～23%，中位总生存期达28.6个月；而接受过索拉非尼治疗的患者，使用纳武单抗治疗后ORR为16%～19%，中位总生存期约为15个月，表明PD-1单抗具有治疗晚期HCC患者的潜力。基于此项临床试验，纳武单抗于2017年9月获得美国食品药品管理局快速审批批准用于HCC患者的二线治疗，用药前无须进行PD-L1表达检测。

KEYNOTE-224显示，104例曾接受索拉非尼治疗的HCC患者接受帕博利珠单抗治疗后，1%的患者达到完全缓解，16%的患者达到部分缓解，ORR为17%，另有44%的患者病情稳定，可见，PD-1单抗用于治疗晚期HCC患者的效果显著，这也进一步支持了在HCC患者中使用帕博利珠单抗进行二线治疗。

2019年美国临床肿瘤协会年会发布了纳武单抗联合伊匹单抗治疗晚期HCC的临床数据，结果显示ORR可达31%，最长中位生存期达23个月，证实免疫检查点抑制剂联合使用的优越性。我国研发的PD-1单抗SHR-1210联合阿帕替尼治疗晚期HCC、胃癌和食管胃结合部癌的NCT02942329研究显示，在8例可评价疗效的HCC患者中，ORR和疾病控制率分别为50%和93.8%，认为PD-1单抗联合抗血管生成靶向药物有治疗晚期HCC的潜力。更优的单药或者联用方案正在探索中，以明确免疫检查点抑制剂在HCC治疗中的价值，并逐步走向大规模的HCC临床治疗应用。

1.6 增强T细胞功能的免疫调节剂

吲哚胺2，3-双加氧酶能够催化肿瘤微环境中的色氨酸代谢，造成色氨酸短缺，进而影响T细胞的活性。使用免疫检查点抑制剂治疗，会诱导HCC微环境中的吲哚胺2，3-双加氧酶表达上调，导致免疫检查点抑制剂的适应性抵抗。一项Ⅰ/Ⅱ期临床研究KEYNOTE-037发现，吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂与帕博利珠单抗联用，能够使55%的晚期实体瘤(包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾母细胞癌、子宫内膜癌、尿路上皮癌和鳞状细胞癌)患者出现客观反应，这种联合治疗方法给HCC的治疗提供了有力的依据。

以T细胞为核心的免疫治疗能使一些HCC患者从中获益，但是部分治疗应答的患者最终还是会出现免疫逃逸和耐药。如HLA或β2-微球蛋白编码基因突变或缺失导致抗原呈递受阻、编码干扰素相关受体的Janus激酶1或Janus激酶2基因的突变会阻碍干扰素受体信号转导，从而抵抗PD-1抗体的治疗。另外，HLA-Ⅰ类分子的基因型也会影响免疫检查点抑制剂的疗效，如HLA-B*15:01基因型可能会削弱T细胞受体的作用强度，从而影响对新抗原的有效识别，导致肿瘤发生免疫逃逸。而非T细胞依赖的免疫治疗方法，可作为肿瘤发生免疫逃逸后的替代选择。

肝脏内NK细胞数量庞大，占肝脏淋巴细胞总数的30%以上，同时肝脏驻留的NK细胞的分化和功能状态也异于外周血和脾脏中的NK细胞，对肿瘤的杀伤能力更强。有研究在HCC肝移植治疗后，通过静脉注射来自供肝的活化NK细胞，Ⅰ期临床试验结果显示安全有效。另外，永生化的NK细胞系NK-92细胞对包括HCC在内的各种恶性肿瘤均具有高度毒性，已成功进入临床试验阶段，NK-92细胞具有持续和无限的增殖能力，临床试验也证明NK-92细胞具有安全性，并已取得一定的临床疗效。

NK细胞对肿瘤的杀伤能力虽弱于T细胞，但能够识别和杀伤因HLA分子缺失而逃避T细胞杀伤的肿瘤细胞，是对以T细胞为核心治疗策略的一个很好的补充。

2.2 溶瘤病毒

溶瘤病毒具有可选择性破坏肿瘤细胞而不损伤正常细胞的特性，可通过多种机制促进抗肿瘤T细胞应答，包括刺激促炎细胞因子的产生和破坏免疫抑制细胞类型，如肿瘤微环境中的癌相关成纤维细胞；此外，溶瘤病毒感染产生的促炎环境可以将免疫抑制细胞类型(如M2型巨噬细胞)转化为更强的抗肿瘤表型；最后，溶瘤病毒可以通过上调参与抗原的加工和递呈的通路，包括增加肿瘤细胞的主要组织相容性复合体的表达，提高免疫系统对肿瘤细胞的识别。

JX-594是一种溶瘤牛痘病毒，选择性地在表皮生长因子受体-大鼠肉瘤病毒通路异常活化、胸苷激酶过度表达的肿瘤细胞中复制，从而保证该病毒特异性侵染HCC细胞，避免损害正常细胞。另外，JX-594还能表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，通过裂解肿瘤细胞释放抗原、分泌细胞因子调控免疫微环境等机制促进抗肿瘤免疫应答，对晚期HCC患者疗效显著。目前已有溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂联合治疗的临床试验，这些组合疗法可能提高免疫敏感肿瘤(如黑色素瘤)的应答率，也可能增加对免疫检查点抑制剂耐药肿瘤治疗的敏感性。

应用于HCC的新的免疫治疗手段和联合治疗策略逐渐增多，特定的患者如何选择最适合的治疗方式逐步成为迫切需要解决的问题。PD-L1的表达水平、肿瘤突变负荷和微卫星不稳定等指标对免疫检查点抑制剂疗效的预测价值，提供了基于生物标志物对患者进行分型并指导治疗方案选择的理论依据。基于肿瘤中心和浸润边缘T淋巴细胞浸润频率和分布模式而建立免疫评分系统，可以将肿瘤分为热肿瘤、免疫排斥、免疫抑制、冷肿瘤四种类型，并为免疫治疗策略的选择提供有益参考。如对于热肿瘤，因有一定数量的肿瘤特异性T细胞能够抵达中心，利用免疫检查点抑制剂恢复T细胞的杀伤活性，即能取得显著的抗肿瘤疗效；冷肿瘤因缺乏肿瘤特异性T细胞，需要通过放疗、溶瘤病毒等方法促进T细胞反应和浸润，或者通过过继细胞疗法直接输注大量肿瘤特异性T细胞杀伤肿瘤；免疫排斥和免疫抑制性肿瘤则重点通过促进T细胞归巢、打破T细胞浸润屏障的治疗策略提升抗肿瘤免疫反应。

HCC属于高度免疫抑制型肿瘤，突变负荷和免疫原性较高，肿瘤边缘存在一定数量的T细胞浸润，但是肿瘤中心T细胞的数量一般较少；另外，浸润T细胞常常处于功能耗竭状态。肿瘤微环境处于高度免疫抑制状态，提示HCC的免疫治疗可选用溶瘤病毒等方法促进T细胞归巢、打破T细胞浸润屏障；使用免疫检查点抑制剂或其他能够增强T细胞功能的免疫调节剂恢复T细胞的杀伤活性；联合使用多种免疫治疗策略以获得更为显著的治疗效果。若因HLA缺失突变等，导致以T细胞为核心的治疗方法耐药，也可选择NK细胞等治疗策略，以再次实现对肿瘤的杀伤和控制。

综上，HCC的高度免疫抑制性提示HCC具有复杂性及难治性，而免疫治疗和联合治疗策略不断取得的进步，将使越来越多的晚期HCC患者从联合免疫治疗中获益。

节选自：医学综述2019年8月第25卷第15期

肿瘤医学论坛综合整理