基因测序
高通量测序行业是基因测序行业的领导者。在这辞旧迎新之际，就让我们一起来看看高通量测序行业发展。
岁末将走，新年即至，回顾2017年基因测序行业，政策大好，资本加持，测序大佬上市，行业热点不断，这其中，测序技术的快速发展在其中起强大的推动作用。
当我们在谈测序行业发展时，不得不谈测序技术经历的三次变革，第一代Sanger测序技术，以Sanger双脱氧终止法的测序原理进行测序，1986年，推出测序仪实现了商业化，其中最具里程碑的事件是人类基因组计划HGP，当年全球科学家耗时近十年完成了人类基因组草图，然而Sanger测序通量低，成本高，耗时长，像HGP这样奢侈的案例是没法复制到其他物种基因组学的大规模测序项目中。
距离第一代测序技术的20年后，测序技术发生了一次重大变革，自2005年开始，以罗氏的454、Illumina 的 Solexa、LifeTechnologies的Solid为开端的第二代高通量测序技术开始登上舞台。第二代高通量测序以边合成边测序为原理，通过对PCR分子簇上碱基连接的荧光信号进行捕获，并转换为碱基信息，与Sanger测序相比，具有通量高，单碱基成本低的优势，并立刻被研究者所应用，发展到今天，早期三国鼎立的辉煌时代已不在，454和Solid都已出局，独留Illumina“一人霸唱天下”。
然而，第二代高通量测序技术读长短的缺陷，在科研和医学的基因组项目研究中弊端日益凸显，如何兼顾高通量和读长长的优势？这似乎为新一代测序仪提供了市场入口。
第三代单分子实时测序技术似乎瞄准了市场入口，2008年，Heliscope Bioscience公司推出了世界第一款单分子测序平台，很不幸，已于2012年申请破产，逐渐走出人们的视野。2011年PacBio公司推出了PacBio RS单分子实时测序仪，通过纳米技术、现代光学系统对单分子合成中的碱基磷酸基团上的荧光信号进行识别，并转换为碱基信息，产出的平均读长在kb级别，相比Illumina的bp级别的读长，优势明显。紧随其后，2011年，Oxford Nanopore Technology公司（简称ONT）推出了单分子实时测序仪MinION和GridION，Nanopore测序原理是通过将单分子碱基穿过纳米孔蛋白的电流变化信号捕获，转换为碱基信息，相对PacBio测序，读长优势更加明显，可谓“江山代有人才出,一代更比一代强”。
测序技术发展到现在，已有30余年，因一、二、三代测序技术的应用市场的差别、测序成本高地不一，各平台上下游发展之别，目前各测序技术都在不同应用方向差异化竞争，呈现三国鼎立之势，不出意外，预计这种现象会在短期内继续存在。
Illumina测序:稳坐测序头把交椅
自2006 年，Illumina 收购 Solexa 后，就开始在测序领域突飞猛进，PK掉了早期的其他第二代高通量测序平台后，在科研服务和临床市场快速发展，涵盖靶向技术、外显子和全基因组测序、基因突变、基因表达、表观遗传学、宏基因组学等应用方向，现如今测序市场占有率已达70%，已然是测序行业巨头地位。
除此，Illumina在测序平台系列的持续升级中，不断将测序成本降低，从Hiseq2000到目前还在广泛应用的Hiseq X，已经将人类全基因组测序成本从10,000美金降至1000美金，到今年发布的Novoseq，测序成本将有望降到100美金，NovaSeq 测序平台单次运行最多可检测48个人类基因组，运行时可间缩至40个小时，这是当初HGP举全球之力的时代所不能想象的。
测序成本的降低，也带来下游服务应用市场的开拓，除了目前临床诊断中成熟应用的无创产前诊断NIPT检测，Illumina测序技术在肿瘤基因检测也异常火热，如肿瘤液体活检，可用于早期癌症筛查，肿瘤患者在靶向药物治疗中进行病情耐药跟踪，连Illumina公司自己都看好这个市场，成立了子公司Grail，专门进行癌症早期筛查。Illumina测序技术在消费级基因检测服务中也潜力无限，如美国的23andMe，是获得FDA 批准的、“直接面向消费者”的基因检测服务，估值超 10亿美元，如国内的wegene，23魔方，360基因等，不过发展之路并不如23andMe乐观，在未来政策和市场管制完善的情况下，消费级基因检测的市场需求会在一定时间节点得到释放。
在中国，大量投资机构看好基于第二代高通量测序的下游终端服务市场，不论是无创产前诊断NIPT，胚胎植入前遗传学筛查/诊断PGD/PGS还是肿瘤基因检测，亦或者是遗传病基因检测，一说起市场估值，不是几十亿就是百亿元的级别。虽然目前基于Illumina测序技术的无创产前诊断NIPT检测的应用已在国内商业化，但肿瘤诊断、胚胎植入前遗传学筛查和诊断、遗传病诊断因技术局限、政策和行业标准等因素，目前并未形成成熟的市场，需要时间积累，未来的路任重而道远。
PacBio测序技术:发展之路，稳中有进
事实上，PacBio测序技术的商业化平台在2012年就已推出了，但其最致命的地方是其高达15%错误率，这直接给研究者留下了第一个不可磨灭的坏印象，由于当时一个芯片产量也比较低，使得PacBio公司并未能在当时的高通量测序领域及时分得一杯羹。
技术的完善需要时间的打磨，到2015年，PacBio在试剂升级和分析软件上都有了突破，这时PacBio RSII平台开始在基因组学科研领域发力，不断有论文发表于Nature，Science等顶级杂志上，就人类基因组研究论文，从基因组完善到组装算法开发，前后发表论文将近10多篇，这个时候，科研人员开始重新审视PacBio单分子实时测序的技术，知道了高达15%的错误率只是原始错误，通过一定测序深度，数据可自我纠错，与此同时，国内提供PacBio测序的服务商也抓住时机大力推广，培育和开发应用市场。
2015年10月，PacBio公司趁热打铁，在美国人类遗传学协会年会ASHG上发布了体型更小通量更高的PacBio Sequel测序平台，这引起科研人员和测序服务公司广泛关注，到2016年年初，国内提供PacBio测序的服务公司，都陆续与PacBio公司开始签约订购，国内科研应用市场需求不断发力，到了2017年，测序服务商借助资本力量在PacBio三代测序市场的大动作不断，纷纷加入到PacBio三代测序市场的角逐中：2016年年初，武汉未来组签约引进6台PacBio Sequel，继续领跑PacBio测序服务市场；2017年年初，南京扬子国资投资集团投资购买10台Sequel，并委托南京诺禾致源生物科技有限公司运行，在运营的过程中，诺禾致源发现到PacBio测序需求的爆发式增长后，2017年8月，又购置了10台Sequel，目前诺禾致源已成为全球PacBio Sequel测序系统的最大用户，为布局中国精准医疗市场加码；2017年7月，安诺优达在融资7亿人民币后，开始重新布局其基因测序战略，于2017年12月，宣布引进10台Sequel，意将打造基因大数据云平台。
当前除了创产前诊断NIPT检测已成熟应用于临床市场，其他肿瘤诊断，生殖医疗诊断及遗传病诊断商业化应用仍未成熟，原因很多，其中一部分原因在于测序技术的局限性，即便Illumina的测序价格逐年在降低，即便已应用了近十年，但其短读长无法检测或准确组装出基因组中重复序列，也就无法应用到基因组结构变异（Structural Variation）、拷贝数变异（Copy Number Variation）等复杂变异引起的疾病研究中，进而限制了Illumina测序技术在科研和医学领域的其他有前景的领域中应用。
2017年，在Genetics in Medicine期刊上报道了世界上第一例，利用第三代PacBio测序分析找到长为2,184bp的致病结构变异的临床案例，而之前该致病结构变异通过第二代高通量测序一直未检出。同时已经有研究人员应用CRISPR/Cas9技术获取特异性序列片段来开发靶向测序panel。似乎PacBio测序技术的长读长在医学应用领域迎来了春天，在基因组结构变异，全长mRNA可变剪接体检测，表观甲基化直接检测等应用领域，给了PacBio测序广阔的发挥空间，但考虑到当前第三代测序的成本和数据准确率，谈PacBio测序的临床应用似乎为时过早。
Nanopore测序:下一个测序市场爆发点？
相对目前商业化应用的Illumina或PacBio测序平台，Nanopore测序技术的原理从提出到走上市场耗时最长，2012年ONT在基因组生物学技术进展年会（AGBT）会议上推出了掌上MinION测序仪，当时轰动一时，但直至2014年ONT才正式开始推出MinION试用计划，但数据准确性及通量等问题，当时还是受到诟病；直至2016年年底，在试剂芯片的不断升级后，芯片的通量、读长和准确率都有大幅提升，所应用的研究范围更加广泛，不过直到2017年，ONT才正式进入中国市场，在中国上海设立办公室，并派驻技术支持专员为中国使用者提供技术服务。
整体来说，这两年，Nanopore测序技术的热点不断。2016年5月，ONT发布了一款比掌上MinION还小的测序仪SmidgION，可直接连接到智能手机上，检测DNA、RNA；2016年12月ONT的MinION平台首次完成了人类基因组测序；同月，ONT再获1.26亿美元融资；2017年3月份，ONT发布了GridION X5，它含有5个流动槽，可同时上机5个芯片，提高单次运行产量，可应用到大规模的测序项目； 2017年7月，ONT上榜了2017年全球50大最聪明公司，其中全球医疗领域最聪明的公司仅14家；2017年下半年，ONT正式进入中国市场，带动了这个全球最大测序服务市场的热情和躁动。
目前中国市场中已购买ONT平台GridION X5测序仪的公司：药明明码引入Nanopore测序技术，欲将与基因大数据分析系统结合应用；药品企业先声药业旗下的先声诊断(Simcere Diagnostics) ，将用Nanopore测序技术协助传染病控制的临床诊断；永诺生物(Forevergen) 旗下ONT测序独立品牌CookGene及武汉未来组，将用Nanopore测序技术开展科研的基因组de novo项目服务。相比以往那些动辄上百万上千万一套的测序仪而言，ONT平台测序仪的价格可谓美好，寻常实验室和小型测序服务商都配置的起，甚至业界有戏称说，一个Iphone就能换个MinION ，预计2018年，ONT平台测序仪会迎来一个预定小高潮。
ONT已在中国市场投放MinION，GridION X5两款测序仪， 从ONT负责中国业务的商务处得知，明年中国市场会迎来更高通量测序仪PromethION，PromethION含有48个区别于MinION的Flowcell，差别之处在于PromethION的每个Flowcell有3,000个channels，一次 48小时的运行即可获得高达6.2 Tb的数据。
在应用方向，除了目前科研市场火热的基因组应用，如取证工作、水质检测、面向消费者的基因检测、生物防御、细胞鉴定、疫情爆发调查和监控、食品安全等，ONT与研究者也不断拓宽医学应用领域，如在肿瘤或遗传病DNA的分析中高分辨率的结构变异分析；在生殖医疗中，可应用于胚胎植入前遗传学筛查(PGS)或胚胎植入前基因诊断(PGD)，检测染色体数目畸变及增加的潜在风险。
第三代PacBio测序技术与第二代Illumina测序技术在读长和通量上各具特点，在不同应用方向和市场上各有优劣，因此暂时尚能和谐共存，甚至在很多应用场景下能有机的结合来提供解决方案，但是作为具有同样甚至更高读长优势的Nanopore测序技术，似乎对PacBio公司来者不善，除了抢夺PacBio公司的科研基因组市场外，ONT似乎也准备在PacBio意欲发力的医学领域分一块蛋糕。
目前，在中国我们所能看到的是，2017年Nanopore测序技术似乎迎来了它的第二个热点时期，那么它眼前的火热是初期市场测序厂家和服务商的“炒作”？还是下一个测序技术真正的爆发点？让时间证明给我们看。
如开篇所说，短期内一、二、三代测序技术将继续“百花齐放”，但竞争差异化较小的第三代测序技术的PacBio和Nanopore测序技术，一方面同是第三代新的测序技术，需要互相配合培育开发第三代测序应用市场，另外一方面，在很多应用领域，两者不免会出现抢夺市场的恶战。当然，测序界的老大哥Illumina也不会坐视不动，国产测序仪也会时刻刷存在感，看能否担得起“国之重器”名号，突出重围，以解国内测序服务商受制于上游测序仪制造商的困境。
作为生物行业的一员，我们并不是没有关系的旁观者，我们可能是科研或医学测序服务的用户，也可能是测序行业生态链中的从业者，还可能是行业的监管部门，我们既可能在两者竞争中得利，也可能被伤及，亦可能需要我们做判断下决策。所以，关注转化医学网，持续获得生物医药行业动态。
上海慧晨生物医学科技有限公司
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