基因測序
高通量測序行業是基因測序行業的領導者。在這辭舊迎新之際，就讓我們一起來看看高通量測序行業發展。
歲末將走，新年即至，回顧2017年基因測序行業，政策大好，資本加持，測序大佬上市，行業熱點不斷，這其中，測序技術的快速發展在其中起強大的推動作用。
當我們在談測序行業發展時，不得不談測序技術經歷的三次變革，第一代Sanger測序技術，以Sanger雙脫氧終止法的測序原理進行測序，1986年，推出測序儀實現了商業化，其中最具里程碑的事件是人類基因組計劃HGP，當年全球科學家耗時近十年完成了人類基因組草圖，然而Sanger測序通量低，成本高，耗時長，像HGP這樣奢侈的案例是沒法複製到其他物種基因組學的大規模測序項目中。
距離第一代測序技術的20年後，測序技術發生了一次重大變革，自2005年開始，以羅氏的454、Illumina 的 Solexa、LifeTechnologies的Solid為開端的第二代高通量測序技術開始登上舞臺。第二代高通量測序以邊合成邊測序為原理，通過對PCR分子簇上鹼基連接的熒光信號進行捕獲，並轉換為鹼基信息，與Sanger測序相比，具有通量高，單鹼基成本低的優勢，並立刻被研究者所應用，發展到今天，早期三國鼎立的輝煌時代已不在，454和Solid都已出局，獨留Illumina“一人霸唱天下”。
然而，第二代高通量測序技術讀長短的缺陷，在科研和醫學的基因組項目研究中弊端日益凸顯，如何兼顧高通量和讀長長的優勢？這似乎為新一代測序儀提供了市場入口。
第三代單分子實時測序技術似乎瞄準了市場入口，2008年，Heliscope Bioscience公司推出了世界第一款單分子測序平臺，很不幸，已於2012年申請破產，逐漸走出人們的視野。2011年PacBio公司推出了PacBio RS單分子實時測序儀，通過納米技術、現代光學系統對單分子合成中的鹼基磷酸基團上的熒光信號進行識別，並轉換為鹼基信息，產出的平均讀長在kb級別，相比Illumina的bp級別的讀長，優勢明顯。緊隨其後，2011年，Oxford Nanopore Technology公司（簡稱ONT）推出了單分子實時測序儀MinION和GridION，Nanopore測序原理是通過將單分子鹼基穿過納米孔蛋白的電流變化信號捕獲，轉換為鹼基信息，相對PacBio測序，讀長優勢更加明顯，可謂“江山代有人才出,一代更比一代強”。
測序技術發展到現在，已有30餘年，因一、二、三代測序技術的應用市場的差別、測序成本高地不一，各平臺上下游發展之別，目前各測序技術都在不同應用方向差異化競爭，呈現三國鼎立之勢，不出意外，預計這種現象會在短期內繼續存在。
Illumina測序:穩坐測序頭把交椅
自2006 年，Illumina 收購 Solexa 後，就開始在測序領域突飛猛進，PK掉了早期的其他第二代高通量測序平臺後，在科研服務和臨床市場快速發展，涵蓋靶向技術、外顯子和全基因組測序、基因突變、基因表達、表觀遺傳學、宏基因組學等應用方向，現如今測序市場佔有率已達70%，已然是測序行業巨頭地位。
除此，Illumina在測序平臺系列的持續升級中，不斷將測序成本降低，從Hiseq2000到目前還在廣泛應用的Hiseq X，已經將人類全基因組測序成本從10,000美金降至1000美金，到今年發佈的Novoseq，測序成本將有望降到100美金，NovaSeq 測序平臺單次運行最多可檢測48個人類基因組，運行時可間縮至40個小時，這是當初HGP舉全球之力的時代所不能想象的。
測序成本的降低，也帶來下游服務應用市場的開拓，除了目前臨床診斷中成熟應用的無創產前診斷NIPT檢測，Illumina測序技術在腫瘤基因檢測也異常火熱，如腫瘤液體活檢，可用於早期癌症篩查，腫瘤患者在靶向藥物治療中進行病情耐藥跟蹤，連Illumina公司自己都看好這個市場，成立了子公司Grail，專門進行癌症早期篩查。Illumina測序技術在消費級基因檢測服務中也潛力無限，如美國的23andMe，是獲得FDA 批准的、“直接面向消費者”的基因檢測服務，估值超 10億美元，如國內的wegene，23魔方，360基因等，不過發展之路並不如23andMe樂觀，在未來政策和市場管制完善的情況下，消費級基因檢測的市場需求會在一定時間節點得到釋放。
在中國，大量投資機構看好基於第二代高通量測序的下游終端服務市場，不論是無創產前診斷NIPT，胚胎植入前遺傳學篩查/診斷PGD/PGS還是腫瘤基因檢測，亦或者是遺傳病基因檢測，一說起市場估值，不是幾十億就是百億元的級別。雖然目前基於Illumina測序技術的無創產前診斷NIPT檢測的應用已在國內商業化，但腫瘤診斷、胚胎植入前遺傳學篩查和診斷、遺傳病診斷因技術侷限、政策和行業標準等因素，目前並未形成成熟的市場，需要時間積累，未來的路任重而道遠。
PacBio測序技術:發展之路，穩中有進
事實上，PacBio測序技術的商業化平臺在2012年就已推出了，但其最致命的地方是其高達15%錯誤率，這直接給研究者留下了第一個不可磨滅的壞印象，由於當時一個芯片產量也比較低，使得PacBio公司並未能在當時的高通量測序領域及時分得一杯羹。
技術的完善需要時間的打磨，到2015年，PacBio在試劑升級和分析軟件上都有了突破，這時PacBio RSII平臺開始在基因組學科研領域發力，不斷有論文發表於Nature，Science等頂級雜誌上，就人類基因組研究論文，從基因組完善到組裝算法開發，前後發表論文將近10多篇，這個時候，科研人員開始重新審視PacBio單分子實時測序的技術，知道了高達15%的錯誤率只是原始錯誤，通過一定測序深度，數據可自我糾錯，與此同時，國內提供PacBio測序的服務商也抓住時機大力推廣，培育和開發應用市場。
2015年10月，PacBio公司趁熱打鐵，在美國人類遺傳學協會年會ASHG上發佈了體型更小通量更高的PacBio Sequel測序平臺，這引起科研人員和測序服務公司廣泛關注，到2016年年初，國內提供PacBio測序的服務公司，都陸續與PacBio公司開始簽約訂購，國內科研應用市場需求不斷髮力，到了2017年，測序服務商借助資本力量在PacBio三代測序市場的大動作不斷，紛紛加入到PacBio三代測序市場的角逐中：2016年年初，武漢未來組簽約引進6臺PacBio Sequel，繼續領跑PacBio測序服務市場；2017年年初，南京揚子國資投資集團投資購買10臺Sequel，並委託南京諾禾致源生物科技有限公司運行，在運營的過程中，諾禾致源發現到PacBio測序需求的爆發式增長後，2017年8月，又購置了10臺Sequel，目前諾禾致源已成為全球PacBio Sequel測序系統的最大用戶，為佈局中國精準醫療市場加碼；2017年7月，安諾優達在融資7億人民幣後，開始重新佈局其基因測序戰略，於2017年12月，宣佈引進10臺Sequel，意將打造基因大數據雲平臺。
當前除了創產前診斷NIPT檢測已成熟應用於臨床市場，其他腫瘤診斷，生殖醫療診斷及遺傳病診斷商業化應用仍未成熟，原因很多，其中一部分原因在於測序技術的侷限性，即便Illumina的測序價格逐年在降低，即便已應用了近十年，但其短讀長無法檢測或準確組裝出基因組中重複序列，也就無法應用到基因組結構變異（Structural Variation）、拷貝數變異（Copy Number Variation）等複雜變異引起的疾病研究中，進而限制了Illumina測序技術在科研和醫學領域的其他有前景的領域中應用。
2017年，在Genetics in Medicine期刊上報道了世界上第一例，利用第三代PacBio測序分析找到長為2,184bp的致病結構變異的臨床案例，而之前該致病結構變異通過第二代高通量測序一直未檢出。同時已經有研究人員應用CRISPR/Cas9技術獲取特異性序列片段來開發靶向測序panel。似乎PacBio測序技術的長讀長在醫學應用領域迎來了春天，在基因組結構變異，全長mRNA可變剪接體檢測，表觀甲基化直接檢測等應用領域，給了PacBio測序廣闊的發揮空間，但考慮到當前第三代測序的成本和數據準確率，談PacBio測序的臨床應用似乎為時過早。
Nanopore測序:下一個測序市場爆發點？
相對目前商業化應用的Illumina或PacBio測序平臺，Nanopore測序技術的原理從提出到走上市場耗時最長，2012年ONT在基因組生物學技術進展年會（AGBT）會議上推出了掌上MinION測序儀，當時轟動一時，但直至2014年ONT才正式開始推出MinION試用計劃，但數據準確性及通量等問題，當時還是受到詬病；直至2016年年底，在試劑芯片的不斷升級後，芯片的通量、讀長和準確率都有大幅提升，所應用的研究範圍更加廣泛，不過直到2017年，ONT才正式進入中國市場，在中國上海設立辦公室，並派駐技術支持專員為中國使用者提供技術服務。
整體來說，這兩年，Nanopore測序技術的熱點不斷。2016年5月，ONT發佈了一款比掌上MinION還小的測序儀SmidgION，可直接連接到智能手機上，檢測DNA、RNA；2016年12月ONT的MinION平臺首次完成了人類基因組測序；同月，ONT再獲1.26億美元融資；2017年3月份，ONT發佈了GridION X5，它含有5個流動槽，可同時上機5個芯片，提高單次運行產量，可應用到大規模的測序項目； 2017年7月，ONT上榜了2017年全球50大最聰明公司，其中全球醫療領域最聰明的公司僅14家；2017年下半年，ONT正式進入中國市場，帶動了這個全球最大測序服務市場的熱情和躁動。
目前中國市場中已購買ONT平臺GridION X5測序儀的公司：藥明明碼引入Nanopore測序技術，欲將與基因大數據分析系統結合應用；藥品企業先聲藥業旗下的先聲診斷(Simcere Diagnostics) ，將用Nanopore測序技術協助傳染病控制的臨床診斷；永諾生物(Forevergen) 旗下ONT測序獨立品牌CookGene及武漢未來組，將用Nanopore測序技術開展科研的基因組de novo項目服務。相比以往那些動輒上百萬上千萬一套的測序儀而言，ONT平臺測序儀的價格可謂美好，尋常實驗室和小型測序服務商都配置的起，甚至業界有戲稱說，一個Iphone就能換個MinION ，預計2018年，ONT平臺測序儀會迎來一個預定小高潮。
ONT已在中國市場投放MinION，GridION X5兩款測序儀， 從ONT負責中國業務的商務處得知，明年中國市場會迎來更高通量測序儀PromethION，PromethION含有48個區別於MinION的Flowcell，差別之處在於PromethION的每個Flowcell有3,000個channels，一次 48小時的運行即可獲得高達6.2 Tb的數據。
在應用方向，除了目前科研市場火熱的基因組應用，如取證工作、水質檢測、面向消費者的基因檢測、生物防禦、細胞鑑定、疫情爆發調查和監控、食品安全等，ONT與研究者也不斷拓寬醫學應用領域，如在腫瘤或遺傳病DNA的分析中高分辨率的結構變異分析；在生殖醫療中，可應用於胚胎植入前遺傳學篩查(PGS)或胚胎植入前基因診斷(PGD)，檢測染色體數目畸變及增加的潛在風險。
第三代PacBio測序技術與第二代Illumina測序技術在讀長和通量上各具特點，在不同應用方向和市場上各有優劣，因此暫時尚能和諧共存，甚至在很多應用場景下能有機的結合來提供解決方案，但是作為具有同樣甚至更高讀長優勢的Nanopore測序技術，似乎對PacBio公司來者不善，除了搶奪PacBio公司的科研基因組市場外，ONT似乎也準備在PacBio意欲發力的醫學領域分一塊蛋糕。
目前，在中國我們所能看到的是，2017年Nanopore測序技術似乎迎來了它的第二個熱點時期，那麼它眼前的火熱是初期市場測序廠家和服務商的“炒作”？還是下一個測序技術真正的爆發點？讓時間證明給我們看。
如開篇所說，短期內一、二、三代測序技術將繼續“百花齊放”，但競爭差異化較小的第三代測序技術的PacBio和Nanopore測序技術，一方面同是第三代新的測序技術，需要互相配合培育開發第三代測序應用市場，另外一方面，在很多應用領域，兩者不免會出現搶奪市場的惡戰。當然，測序界的老大哥Illumina也不會坐視不動，國產測序儀也會時刻刷存在感，看能否擔得起“國之重器”名號，突出重圍，以解國內測序服務商受制於上游測序儀制造商的困境。
作為生物行業的一員，我們並不是沒有關係的旁觀者，我們可能是科研或醫學測序服務的用戶，也可能是測序行業生態鏈中的從業者，還可能是行業的監管部門，我們既可能在兩者競爭中得利，也可能被傷及，亦可能需要我們做判斷下決策。所以，關注轉化醫學網，持續獲得生物醫藥行業動態。
上海慧晨生物醫學科技有限公司
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