進入高通量時代，更多的樣本混合上機成為常態。研究人員在構建文庫時，將不同的index加到每個樣品上，就像給它們戴上獨特的“帽子”，這讓生信工程師能在“茫茫reads海”中一眼就看到自己的目標。這一方案降低了測序成本，使臨床基因測序得到廣泛應用。
但是，在實際流程中，不能保證所有操作的準確率100%，總有樣本會“戴錯帽子”。最近研究發現[2-8]，基於ExAmp（排他性擴增）的測序平臺，例如HiSeq 3000/4000、HiSeq X Ten以及NovaSeq， 混樣上機測序會出現index錯誤分配（index hopping）問題， 樣本錯誤分配率超過1%，且對於PCR-free文庫，index hopping比例可高達6%[5]。即使採用繁瑣的non-combinatorial dual index方案來解決這個問題，index汙染率也只能降低到0.08%[5]。
今年6月份，bioRxiv公開了題為《Reliable Multiplex Sequencing with Rare Index Mis-Assignment on DNB-Based NGS Platform》[1]的文章，使用三種主要的文庫製備方法研究了DNB測序平臺的Index hopping問題。
其中，BGISEQ測序儀利用獨特的DNA納米球（DNB）技術，基於滾環複製（RCR）進行文庫擴增，這種線性擴增可以避免常規PCR帶來的錯誤累積。基於DNB的NGS應用僅使用單個index就實現了0.0001％至0.0004％低樣本錯誤分配率。此外，用水代替DNA，加入index，增加空白對照，DNB測序平臺發生錯誤匹配的概率為36 million reads分之一，即0.0000028％。
圖1.不同測序技術的index hopping比例
DNB測序平臺的極低的index hopping比例，不僅可以有效避免樣本的“張冠李戴”，還可帶來以下效果：
1. 高的檢測準確度，保證體細胞低頻突變、HPV檢測等基因檢測的準確性[1]；
2. Single index避免了繁瑣的non-combinatorial dual index帶來的額外成本和勞動力浪費[2]；
3. 避免大通量測序中樣本數據完整性的丟失。
DNB測序平臺具有極少index hopping的原因及解決方法
1.DNA納米球技術的高index保真度
BGISEQ平臺將DNB加載到規則陣列（patterned arrays）上，並利用組合引物錨定測序技術（cPAS）進行測序[9]。獨特的DNB技術採用具有強鏈置換活性的Phi29聚合酶和能夠進行線性擴增的RCR工藝，每個擴增循環都以原始的單鏈環狀DNA文庫為模板，保持每個拷貝子的獨立性（圖2a）。因此，即使出現寡核苷酸的index hopping等錯誤，也不會累積錯誤拷貝，正確的序列總是會在後面的DNA拷貝中複製，保證最高的擴增保真度。
圖2. Index hopping在不同的測序平臺產生的機制
2.信號外溢造成極少的index hopping
Index汙染可以通過實驗操作、PCR錯誤、測序錯誤、寡核苷酸合成錯誤引入。為了檢測BGISEQ平臺極少index hopping的原因，研究人員首先找到那些出現錯配的DNB，調查其測序質量。發現這些不匹配的DNB在index區域的平均Q30僅為36.66％，顯著低於正確匹配的DNB的index區域（平均Q30 = 91.19％）。同時，統計了DNB在芯片上的位置，並計算了與其周圍DNB共享相同index序列的概率。平均而言，無index hopping的DNB與相鄰DNB共享相同index序列的概率為20.21％，存在index hopping的DNB共享相同index 的概率則為57.04％。該結果表明相鄰DNB的信號外溢造成了index hopping。對於這種情況，
index的測序質量通常偏低，研究人員可以通過Q30>60%過濾來降低因此產生的index hopping。3. Oligo合成汙染為另一主要原因
與原因2不同，研究人員還發現EFEMP2 / LOX被錯誤分配到index 7的 reads的index區域的測序質量值很高（平均Q30 = 85.03％和82.38％），如表1所示。index 2和index 7之間的漢明距離是8，索引3和7之間的漢明距離是9，因此，EFEMP2 / LOX 的index hopping也不太可能由隨機測序錯誤引起的。
很可能的一個原因是，Index 7 oligo在合成或寡核苷酸處理過程中汙染了其他寡核苷酸，導致在測序時候在其他的裡面發現了index7。寡核苷酸合成汙染可能是index錯誤分配的另一個主要原因，可通過使用IDT的TruGrade的oligo，有效避免此類index hopping的產生。
表1. BGISEQ平臺的index hopping結果
此外，對於PCR-free的文庫，由於起始量高，需要加入更多濃度的index，因此相比PCR文庫更容易造成去除不乾淨的情況[2]，如圖3所示：
圖3. PCR-free和PCR在兩種測序芯片上index hopping比例的比較[2]
除了常規PCR文庫外，文中還對PCR-free文庫在BGISEQ平臺的index hopping情況進行調查，未經過任何Q30過濾的99.9998％精度再次證實了DNB可以在很大程度上最小化index汙染。與上面的常規PCR文庫類似，汙染率平均約為0.0004%。
表2. PCR-free 文庫index汙染比率
最後，對目標區域捕獲文庫進行測試，BGI肺癌試劑盒的數據驗證了DNB測序平臺上的single index不易發生index hopping，可用於準確檢測癌症等疾病的低頻變異。結果顯示在不同庫類型中BGISEQ index hopping比率都非常低，表明DNB測序技術的數據準確性不受文庫構建方法的影響。
未來，測序通量極速擴大是大概率事件，避免樣本的“張冠李戴”顯得更加重要。基於DNB技術的測序平臺，憑藉極低的錯誤分配率和不斷完善的技術，將有望提升數據質量，幫助科研人員牢牢把握精準數據以及背後的重大發現。這對所有科研人員而言，都是一個振奮人心的進步。
BGISEQ測序儀
參考文獻：
[1] Li Q, Zhao X, Zhang W, et al. Reliable Multiplex Sequencing with Rare Index Mis-Assignment on DNB-Based NGS Platform. bioRxiv, 2018: 343137
[2] Illumina. Effects of Index Misassignment on Multiplexing and Downstream Analysis (white paper). 4 (2017). doi:10.1101/125724
[3] Macconaill L E, Burns R T, Nag A, et al. Unique, dual-indexed sequencing adapters with UMIs effectively eliminate index cross-talk and significantly improve sensitivity of massively parallel sequencing[J]. Bmc Genomics, 2018, 19(1):30.
[4] Sinha, R, Stanley G, Gulati GS, et al. Index Switching Causes “Spreading-Of-Signal” Among Multiplexed Samples In Illumina HiSeq 4000 DNA Sequencing. bioRxiv,125724 (2017). doi:10.1101/125724.
[5] Costello M, Fleharty M, Abreu J, et al. Characterization and remediation of sample index swaps by non-redundant dual indexing on massively parallel sequencing platforms. BMC Genomics, 2018 May 8;19(1):332.
[6] Griffiths J A, Lun A T L, Richard A C, et al. Detection and removal of barcode swapping in single-cell RNA-seq data:[J]. Nature Communications, 2018, 9.
[7] Vodák D, Lorenz S, Nakken S, et al. Sample-Index Misassignment Impacts Tumour Exome Sequencing.[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1):5307.
[8] Van der Valk, T. et al. Low rate of index hopping on the Illumina HiSeq X platform. bioRxiv 179028 (2018). doi:10.1101/179028
[9] Huang J, Liang X, Xuan Y, et al. A reference human genome dataset of the BGISEQ-500 sequencer[J]. Gigascience, 2017, 6(5):1-9.
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