缺血性卒中已经成为严重威胁人类健康的临床常见病，治疗手段以早期溶栓为主，但存在治疗时间窗短、不能改善再灌注损伤等问题。中药对脑缺血再灌注损伤的保护作用日益受到重视，如银杏类制剂在临床应用于心脑血管疾病多年，具有良好的疗效。
银杏内酯注射液（GIs）是国内首个获批上市的银杏萜类内酯单体组分含量达99%的注射液，其中银杏内酯B（GB）和白果内酯（BB）分别占34%和48%。研究认为，GB和BB为银杏类制剂中的重要活性成份，其作用机制包括抗兴奋性毒性、抑制氧化应激损伤、抗血小板聚集以及抗炎等，被认为是多靶点多效应的神经保护
越来越多的研究发现，内质网应激与自噬在脑缺血病理过程中发挥着重要作用。目前，关于银杏内酯是否影响缺血后内质网应激和自噬的研究较少，仅有少数研究报道，GB可以通过抑制内质网应激改善丁哌卡因刺激下SHSY-5Y细胞株的死亡，银杏总内酯可以抑制缺血后Beclin-1表达。本研究在验证GIs对脑缺血再灌注损伤治疗作用的基础上，探讨GIs对在体大鼠缺血再灌注内质网应激、自噬的影响，结果显示，GIs减轻脑缺血再灌注急性期损伤，其机制与抑制内质网应激和自噬相关。
研究方法
研究采用Longa法制备大鼠短暂性大脑中动脉阻塞（tMCAO）/再灌注损伤模型，于缺血再灌注1 h后腹腔注射（i.p.，bid）不同剂量的GIs（1.25、2.5、5 mg/kg），连续治疗3 d并进行神经功能评分，干湿重法测定脑组织含水量，TTC染色法测定脑梗死体积；银杏内酯注射液保护作用机制研究分为4组：假手术组（Sham）、假手术+GIs2.5 mg/kg组（Sham+GIs）、模型组（tMCAO+Saline）、模型组+GIs 2.5 mg /kg组（tMCAO+ GIs）。Sham+GIs组与tMCAO+GIs组缺血再灌注1 h给予GIs（i．p．，Bid，2.5 mg /kg），余2组同法给予无菌生理盐水，24 h和72 h时取样，Western Blotting法检测缺血半影区内质网应激、自噬等相关蛋白表达。
研究结果
1：GIs可以改善tMACO大鼠脑缺血再灌注损伤
再灌注后1 h给予GIs的各组大鼠，一般状态明显优于模型对照组。其中，2.5、5.0 mg/kg GIs组与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01，图1 A）；脑组织含水量同样显示2.5、5.0 mg/kg GIs组明显低于模型对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01，图1B）；脑梗死体积结果显示（图1C和D），GIs 1.25、2.5、5.0 mg/kg均显著减少tMCAO大鼠脑梗死体积，与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结果提示，缺血再灌后1 h给予GIs具有改善tMCAO模型大鼠神经运动功能、减轻脑水肿、减小脑梗死体积的作用。
2：GIs抑制脑缺血再灌注损伤所诱导的内质网应激
基础状态下，给予GIs（2.5 mg/kg）24 h或72 h，对大鼠脑组织胞浆内CHOP、caspase12蛋白表达无显著影响。缺血再灌24 h、72 h后，模型组半影区CHOP蛋白表达明显升高，同假手术组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；给予GIs（2.5 mg/kg）抑制CHOP蛋白水平的升高，与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01，图2 A、B、D、E）。缺血再灌24 h，模型组大鼠半影区caspase 12成熟体蛋白表达明显升高，与假手术组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）；给予GIs（2.5 mg/kg）抑制caspase12成熟体蛋白水平的升高，较模型组差异具有统计学意义（P＜0.01，图2 A、C）；至缺血再灌72 h，模型组大鼠caspase12成熟体蛋白表达与假手术组相比差异无统计学意义（图2 D、F）。结果表明，GIs抑制脑缺血再灌注损伤所诱导的内质网应激。
3：GIs抑制tMCAO所致自噬水平的上调
基础状态下，给予GIs（2.5 mg/kg）24 h或72 h，对大鼠脑组织胞浆内P62及LC3蛋白表达无明显影响。tMCAO模型缺血再灌24、72 h，P62蛋白表达下降，而LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ的比率上升，同假手术组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），表明缺血再灌后脑内自噬水平升高；给予GIs后能抑制tMCAO所致自噬水平升高，表现为抑制P 62 的下降和LC3Ⅱ/Ⅰ比率的上升，与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05，图 3） 。结果提示，银杏内酯注射液抑制tMCAO所致自噬水平的上调。
讨论与分析
缺血再灌注损伤的病理机制较复杂，包括兴奋氨基酸和氧自由基的释放增加、内质网功能紊乱、线粒体释放细胞凋亡因子、炎症因子的产生等一系列“瀑布样”级联反应事件，内质网应激是其中必不可少的环节之一。脑缺血后，细胞内未折叠蛋白增加，内质网肿胀，引起未折叠蛋白反应（UPR），UPR初始状态下发挥保护作用，随着反应的延长和加重，引起细胞死亡，这种死亡方式通常是通过凋亡引起，主要在chop、caspase 12、JNK介导下发生。CHOP主要通过下调Bcl-2，上调ＲOS发挥作用。激活的caspase 12可加工胞浆中下游 caspases影响凋亡的进程。
研究发现，银杏内酯可以上调Bcl-2/Bax比率，下调caspase 3的表达，发挥抗凋亡作用。此外，内质网应激也是自噬发生的重要因素，可通过IRE1-XBP1、PERK-eIF2及ATF6三条信号通路诱导自噬。有研究报道，缺血后自噬诱导的死亡也是内质网应激过度的后果。抑制内质网应激可以发挥缺血后神经保护作用，CHOP基因敲除鼠较正常小鼠有更好的抗缺血作用。本研究结果显示，GIs抑制再灌24 h、72 h CHOP、caspase12成熟体蛋白水平的升高，抑制缺血再灌注引起的内质网应激。
内质网应激的结果之一是诱导细胞内自噬的发生。脑缺血后，细胞组分遭到破坏、内质网应激的发生、ROS的大量生成等因素诱导自噬水平上升。缺血初期或轻度缺血的情况下，自噬消除细胞受损物质，提供能量和营养，发挥保护作用。再灌后，随着自噬反应的加重和不受控制，消耗大量的重要细胞组分和促存活因子，引起能量耗竭、DNA断裂等，激活凋亡、自噬性死亡、坏死。自噬相关基因Atg 7敲除或应用自噬抑制剂3-MA，可以改善缺血后脑损伤。本研究结果显示，GIs抑制tMCAO大鼠缺血复灌24 h、72 h LC3I向LC3II的转化，抑制自噬底物P 62的降低，抑制缺血再灌注引起的自噬水平过度升高，发挥神经保护作用。
综上所述，GIs可以减轻缺血急性期治疗损伤引起的神经功能障碍、脑水肿，减小梗死体积，其机制与抑制内质网应激和自噬相关。
参考资料：兰新新,曹磊,王林晓等.银杏内酯注射液抑制脑缺血再灌注模型大鼠内质网应激和自噬[J] .中国临床药理学与治疗学.
编辑 | 丁慧鑫
审校 | 董晓慧
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