撰文 | 鹹姐
腫瘤的發生發展涉及連續的不受限制的局部生長的體細胞改變，這個過程包括癌基因的激活和抑癌基因的失活或部分失活。外顯子測序技術使得經常發生的基因損傷被識別，但是那些發生改變不太頻繁卻有著重要作用的驅動基因的檢測仍然存在困難。基於CRISPR-Cas9的文庫篩選的發展極大地推動了基因功能的發現，已經成功地應用於各種轉化細胞系中，在基因組水平上研究了基因的必要性和特定環境的脆性【1,2】，然而隨著研究的深入，一些問題不得不引起人們重視。
癌基因和抑癌基因往往表現出很強的背景特異性，這取決於腫瘤類型、細胞來源和環境因素，包括代謝、炎症和微生物等【3,4】。克隆選擇和擴增導致了相當大的遺傳和表型異質性，這就需要能夠概括腫瘤進展複雜性的先進實驗模型。此外，不知讀者是否還記得，3月23日BioArt發表的那篇《2D還是3D？癌症研究模型選擇需慎重》的文章，沒錯，雖然癌症細胞系很容易用於大規模的實驗，但它們不能反映人體病理生理的所有方面。因此，在原發腫瘤細胞中進行篩選將有助於研究患者的特異性反應、與腫瘤微環境的相互作用，以及涉及腫瘤幹細胞、細胞分化等的過程。然而，技術和經濟條件都限制著基於類器官的CRISPR-Cas9篩選平臺的發展。
結直腸癌（CRC）具有顯著的遺傳和表型異質性【5】，近些年來，患者來源的腫瘤類器官作為臨床前模型的出現，很好地再現了CRC的分子和表型特徵。在三維基質中，腫瘤和正常的上皮細胞可以被擴展，並維持著對控制增殖和分化等重要功能的外部因素的依賴【6】。已有研究證實，利用CRISPR-Cas9技術，可以引入所需的突變來轉化正常的類器官並誘導異種移植的致瘤性生長【7,8】。
由此，為了解決上述問題，為了促進高通量基因檢測和腫瘤驅動基因的功能鑑定的發展，2020年4月28日，來自德國癌症協會（DKTK）的Henner F. Farin研究團隊在Cell Stem Cell上在線發表題為 Pooled In Vitro and In Vivo CRISPR-Cas9 Screening Identifies Tumor Suppressors in Human Colon Organoids的文章，開發了一個基於人類結腸類器官的CRISPR-Cas9基因篩選平臺，使得利用類器官進行體外和體內移植後腫瘤抑制基因的篩選鑑定成為可能，並且當結合獨特的分子識別物（UMI）時，可以實現在克隆水平上進行表型研究，對於腫瘤個性化治療具有巨大的應用潛力。
為了在人類結腸類器官中建立混合篩選模型，本文研究人員首先尋找了一種能夠進行確定的陽性選擇的表型特徵，在培養基中添加重組的TGF-β有效地抑制穩定表達Cas9的人正常結腸類器官的生長，而再轉入靶向TGF-β受體2（TGFBR2）的sgRNA時可以挽救此抑制毒性，從而為研究該模型的性能和可擴展性提供了一個陽性對照，同時證實該模型中，轉導的感染複數（multiplicity of infection，MOI）小於1時既可以有效地進行CRISPR-Cas9修飾。
隨後，為了研究結腸類器官中多個gRNA的效率，研究人員針對TGF-β通路中的6個關鍵基因設計了一個含有2200個gRNA的“訓練文庫”並轉入穩定表達Cas9的人正常結腸類器官中（圖1），結合下一代測序技術分析，證實了利用該模型進行CRISPR-Cas9基因篩選的可行性。但是也同時指出，gRNA結合位點的基因組位置或來自各種gRNA設計工具的評分與其活性無關，表明現存的設計規則在類器官中預測gRNA的有效性的能力是有限的。進一步地將該模型的性能與肝癌細胞系HepG2進行比較發現，在類器官中高效的gRNA在HepG2細胞中普遍表現良好。HepG2細胞的活性一般與類器官的功能無關，但是，當對HepG2細胞中活性最高的10個TGFBR1/2 gRNA進行限制後，有效gRNA的比例從15%增加到40%，由此提示，
在異種細胞中進行預先篩選可以獲得更小、更有效的gRNA文庫，從而提高類器官篩選模型的性能。 圖1 “訓練文庫”的實驗設置和組成
目前，全面的腫瘤測序計劃只確定了在CRC中反覆突變的有限數量的腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene, TSG），為了研究在CRC中較少出現的驅動基因的作用，並覆蓋多種生物途徑，研究人員在具有APC-/-和KRASG12D突變的癌前類器官中設計篩選了一個泛癌TSG gRNA庫，並將其進行小鼠皮下異種移植，以便在複雜的腫瘤微環境中研究克隆優勢（圖2）。實驗發現最普遍的TSG是 TGFBR2，其次是CRC中已知的其他驅動基因以及之前未被鑑定的一些介導CRC生長的因子。但是，本文作者仍然發現在高度富集的gRNA中有許多靶向中性和必需基因的對照gRNA，表明存在著假陽性，而這可能是由於在長期選擇過程中的中性漂移造成的。因此，為了驗證和深入瞭解來自類器官的腫瘤的克隆組成，研究人員生成了一個將每個gRNA與唯一的分子標識符（UMI）配對的文庫，進行二次篩選，以適應克隆漂移和區分克隆大小和豐度，結果表明，對克隆漂移的校正極大地提高了CRISPR-Cas9在類器官中的分辨率。隨後研究人員利用這種克隆優勢的定量測定方法比較單個TSG對克隆大小和數量的影響，證明了在移植的類器官中的克隆追蹤可以用來直接比較靶向人類腫瘤抑制因子的gRNA的表型強度和外顯率。
圖2 小鼠皮下異種移植實驗模式圖
綜上所述，本研究開發了一個在人類結腸類器官中的混合CRISPR-Cas9篩選平臺（圖3），並證明該技術可以對在體外和異種移植後給予陽性選擇的基因進行無偏倚檢測。同時解決了基於類器官篩選的重要困難，即對gRNA功能的預測以及長期選擇過程中的克隆漂移。
事實證明UMI偶聯的gRNA文庫能夠顯著提高篩選性能，並可以在克隆水平上進行基因擾動分析。該方法將促進原代上皮細胞的基因篩選，而這無疑對個性化腫瘤學的發展具有重大的影響。
圖3 在人類結腸類器官中的混合CRISPR-Cas9篩選平臺
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.04.003
製版人：珂
參考文獻
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