撰文 | 咸姐
肿瘤的发生发展涉及连续的不受限制的局部生长的体细胞改变，这个过程包括癌基因的激活和抑癌基因的失活或部分失活。外显子测序技术使得经常发生的基因损伤被识别，但是那些发生改变不太频繁却有着重要作用的驱动基因的检测仍然存在困难。基于CRISPR-Cas9的文库筛选的发展极大地推动了基因功能的发现，已经成功地应用于各种转化细胞系中，在基因组水平上研究了基因的必要性和特定环境的脆性【1,2】，然而随着研究的深入，一些问题不得不引起人们重视。
癌基因和抑癌基因往往表现出很强的背景特异性，这取决于肿瘤类型、细胞来源和环境因素，包括代谢、炎症和微生物等【3,4】。克隆选择和扩增导致了相当大的遗传和表型异质性，这就需要能够概括肿瘤进展复杂性的先进实验模型。此外，不知读者是否还记得，3月23日BioArt发表的那篇《2D还是3D？癌症研究模型选择需慎重》的文章，没错，虽然癌症细胞系很容易用于大规模的实验，但它们不能反映人体病理生理的所有方面。因此，在原发肿瘤细胞中进行筛选将有助于研究患者的特异性反应、与肿瘤微环境的相互作用，以及涉及肿瘤干细胞、细胞分化等的过程。然而，技术和经济条件都限制着基于类器官的CRISPR-Cas9筛选平台的发展。
结直肠癌（CRC）具有显著的遗传和表型异质性【5】，近些年来，患者来源的肿瘤类器官作为临床前模型的出现，很好地再现了CRC的分子和表型特征。在三维基质中，肿瘤和正常的上皮细胞可以被扩展，并维持着对控制增殖和分化等重要功能的外部因素的依赖【6】。已有研究证实，利用CRISPR-Cas9技术，可以引入所需的突变来转化正常的类器官并诱导异种移植的致瘤性生长【7,8】。
由此，为了解决上述问题，为了促进高通量基因检测和肿瘤驱动基因的功能鉴定的发展，2020年4月28日，来自德国癌症协会（DKTK）的Henner F. Farin研究团队在Cell Stem Cell上在线发表题为 Pooled In Vitro and In Vivo CRISPR-Cas9 Screening Identifies Tumor Suppressors in Human Colon Organoids的文章，开发了一个基于人类结肠类器官的CRISPR-Cas9基因筛选平台，使得利用类器官进行体外和体内移植后肿瘤抑制基因的筛选鉴定成为可能，并且当结合独特的分子识别物（UMI）时，可以实现在克隆水平上进行表型研究，对于肿瘤个性化治疗具有巨大的应用潜力。
为了在人类结肠类器官中建立混合筛选模型，本文研究人员首先寻找了一种能够进行确定的阳性选择的表型特征，在培养基中添加重组的TGF-β有效地抑制稳定表达Cas9的人正常结肠类器官的生长，而再转入靶向TGF-β受体2（TGFBR2）的sgRNA时可以挽救此抑制毒性，从而为研究该模型的性能和可扩展性提供了一个阳性对照，同时证实该模型中，转导的感染复数（multiplicity of infection，MOI）小于1时既可以有效地进行CRISPR-Cas9修饰。
随后，为了研究结肠类器官中多个gRNA的效率，研究人员针对TGF-β通路中的6个关键基因设计了一个含有2200个gRNA的“训练文库”并转入稳定表达Cas9的人正常结肠类器官中（图1），结合下一代测序技术分析，证实了利用该模型进行CRISPR-Cas9基因筛选的可行性。但是也同时指出，gRNA结合位点的基因组位置或来自各种gRNA设计工具的评分与其活性无关，表明现存的设计规则在类器官中预测gRNA的有效性的能力是有限的。进一步地将该模型的性能与肝癌细胞系HepG2进行比较发现，在类器官中高效的gRNA在HepG2细胞中普遍表现良好。HepG2细胞的活性一般与类器官的功能无关，但是，当对HepG2细胞中活性最高的10个TGFBR1/2 gRNA进行限制后，有效gRNA的比例从15%增加到40%，由此提示，
在异种细胞中进行预先筛选可以获得更小、更有效的gRNA文库，从而提高类器官筛选模型的性能。 图1 “训练文库”的实验设置和组成
目前，全面的肿瘤测序计划只确定了在CRC中反复突变的有限数量的肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene, TSG），为了研究在CRC中较少出现的驱动基因的作用，并覆盖多种生物途径，研究人员在具有APC-/-和KRASG12D突变的癌前类器官中设计筛选了一个泛癌TSG gRNA库，并将其进行小鼠皮下异种移植，以便在复杂的肿瘤微环境中研究克隆优势（图2）。实验发现最普遍的TSG是 TGFBR2，其次是CRC中已知的其他驱动基因以及之前未被鉴定的一些介导CRC生长的因子。但是，本文作者仍然发现在高度富集的gRNA中有许多靶向中性和必需基因的对照gRNA，表明存在着假阳性，而这可能是由于在长期选择过程中的中性漂移造成的。因此，为了验证和深入了解来自类器官的肿瘤的克隆组成，研究人员生成了一个将每个gRNA与唯一的分子标识符（UMI）配对的文库，进行二次筛选，以适应克隆漂移和区分克隆大小和丰度，结果表明，对克隆漂移的校正极大地提高了CRISPR-Cas9在类器官中的分辨率。随后研究人员利用这种克隆优势的定量测定方法比较单个TSG对克隆大小和数量的影响，证明了在移植的类器官中的克隆追踪可以用来直接比较靶向人类肿瘤抑制因子的gRNA的表型强度和外显率。
图2 小鼠皮下异种移植实验模式图
综上所述，本研究开发了一个在人类结肠类器官中的混合CRISPR-Cas9筛选平台（图3），并证明该技术可以对在体外和异种移植后给予阳性选择的基因进行无偏倚检测。同时解决了基于类器官筛选的重要困难，即对gRNA功能的预测以及长期选择过程中的克隆漂移。
事实证明UMI偶联的gRNA文库能够显著提高筛选性能，并可以在克隆水平上进行基因扰动分析。该方法将促进原代上皮细胞的基因筛选，而这无疑对个性化肿瘤学的发展具有重大的影响。
图3 在人类结肠类器官中的混合CRISPR-Cas9筛选平台
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.04.003
制版人：珂
参考文献
1. Hart, T., Chandrashekhar, M., Aregger et al. (2015). High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell 163, 1515–1526.
2. Wang, T., Birsoy, K., Hughes, N.W. et al. (2015). Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science 350, 1096–1101.
3. Berger, A.H., Knudson, A.G., and Pandolfi, P.P. (2011). A continuum model for tumour suppression. Nature 476, 163–169.
4. Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., and Saur, D. (2017). Tissue-specific tumorigenesis: context matters. Nat. Rev. Cancer 17, 239–253.
5. Cancer Genome Atlas Network (2012). Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature 487, 330–337.
6. van de Wetering, M., Francies, H.E., Francis et al. (2015). Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell 161, 933–945.
7. Matano, M., Date, S., Shimokawa, M., Takano, A. et al. (2015). Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nat. Med. 21, 256–262.
8. Schwank, G., Koo, B.-K., Sasselli, V. et al. (2013b). Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell 13, 653–658.
