Nature子刊：寡糖類藥物GV-971重塑腸道菌群平衡

原創 莫沉 微生態 2019-10-01

導讀

腸道菌群失調與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)進展之間存在關聯，但腸道菌群在AD發病機制中的具體作用仍不清楚。本文中，研究者發現了將腸道菌群失調和AD進展相關神經炎症相關聯的潛在的機制。研究者藉助AD小鼠模型，首次發現在AD進展過程中，腸道菌群組成的變化可以導致外周循環中苯丙氨酸和異亮氨酸的積累，從而促進Th1細胞等外周免疫細胞的分化和增殖，而大腦浸潤的局部的Th1免疫細胞與M1小膠質細胞活化有關，誘發大腦神經炎症，最終導致AD相關的神經炎症。更為重要的是，在兩組小型獨立隊列研究中，輕度認知障礙(mild cognitive impairment, MCI)患者中, 其外周循環的苯丙氨酸和異亮氨酸濃度以及血液中Th1細胞比例均有升高。此外，在國內一項三期臨床實驗中發現，寡糖類抗AD藥物GV-971，通過重塑腸道菌群平衡，降低菌群代謝產物特別是苯丙氨酸和異亮氨酸的產生，降低外周及中樞炎症，減少腦內Aβ蛋白沉積和Tau的過度磷酸化，從而改善認知功能障礙。綜上所述，本研究突出強調了腸道菌群失調誘發的相關神經炎症在AD進展中的重要作用，為闡明AD複雜疾病的發病機制提供了全新的研究視角，同時提供了一種通過重塑腸道菌群來治療AD的新的治療策略。

論文ID

原名：Sodium oligomannate therapeutically remodels gut microbiota and suppresses gut bacterial amino acids-shaped neuroinflammation to inhibit Alzheimer’s disease progression

譯名：寡糖類藥物GV-971重塑腸道菌群平衡，減輕腦內神經炎症進而抑制阿爾茨海默病的進展

期刊：Cell Research

IF：17.848

通訊作者單位：中國科學院上海藥物研究所

結果

1 AD的進展與腸道菌群的改變和免疫細胞浸潤有關

為了評估腸道微菌群的變化在AD發病機制中的作用，研究者使用了5XFAD轉基因(Tg)小鼠模型，該模型目前廣泛用於AD研究中，用來研究AD相關的病理特徵，包括嚴重加速的認知障礙、出生後2個月的澱粉樣蛋白沉積、出生後4個月的突觸變性以及6個月的行為學改變等。實驗小鼠大腦海馬體中突觸素的表達水平從第7個月顯著下降到第9個月，表明突觸退化(圖1A)，而Tg小鼠的行為測試顯示9個月大時辨別學習能力明顯下降(圖1B)。然後，研究者使用16S核糖體RNA(rRNA)基因擴增子測序比較了AD進展中不同階段的Tg小鼠和WT小鼠的腸型變化。結果發現，腸道菌群中有顯著的聚類效應，Tg小鼠聚類為Muribaculaceae家族下的Norank屬，WT小鼠聚類為Lactobacillus屬(圖1C)。

研究者發現，在Tg小鼠的AD進展過程中，腸道菌群組成發生了顯著的變化，而在WT小鼠中幾乎沒有觀察到任何變化(圖1D)。利用OTUs跟蹤Tg小鼠體內不同菌門丰度的動態變化，發現在疾病進展過程中Tg小鼠腸道微生物有兩種明顯的變化。在2個月齡時，Bacteroides, Firmicutes和Verrucommicrobia是門水平上最豐富的三種細菌(分別為47.3%、33.0%和12.2%)。在7個月齡時，Firmicutes成為優勢門(62.8%)，而Bacteroides和Verrucommicrobia的丰度明顯下降，表明菌群的類型發生了變化(圖1E)。這些結果表明，與WT小鼠的腸道微生物形成了強烈的對比的是，Tg小鼠的腸道菌群是高度動態變化的。同時，在另一種廣泛用於AD研究的模型APP/PS1雙轉基因小鼠模型也得到了類似的結果。小膠質細胞激活的標誌IBA1在AD小鼠腦組織切片中的免疫染色顯示了小膠質細胞激活的兩個明顯階段，分別在第3個月和7-9個月(圖1F)。在2-3個月大的早期階段，M1和M2小膠質細胞比例都持續增加，而在接下來的幾個月中，M1亞型比例繼續增加，並在7-9個月達到高峰，而M2型小膠質細胞從3個月到5個月下降，此後保持較低水平(圖1G)。觀察到Tg小鼠大腦中CD45high細胞的頻率明顯高於WT小鼠，與IBA1染色結果相似(圖1F，H)。研究者進一步分析了在AD進展過程中的一系列時間點中CD45high細胞亞型的變化(圖1I)。浸潤性Th1和Th2細胞是CD4+細胞的兩種主要亞型，研究者發現在實驗觀察期間其表現出與M1和M2小膠質細胞相似的動力學變化(圖1K)。此外，研究者還分析了在AD進展的早期和晚期腸道微生物丰度和大腦免疫細胞比例之間的相關性。研究者注意到，細菌的丰度變化在早期(2-3個月)與Th2和M2細胞的變化一致(圖1L，頂部)，在晚期(7-9個月)則與Th1和M1細胞的變化相關(圖1L，底部)。

圖1. 5XFAD轉基因(Tg)小鼠在AD疾病進展過程中的腸道失調和免疫細胞變化。

A. 5XFAD轉基因(Tg)小鼠在2、3、5、7、9月齡海馬突觸素相對RNA表達水平的變化及野生型(WT)小鼠2月齡海馬突觸素相對RNA表達水平的變化.

B. 在評估5XFAD轉基因(Tg)小鼠在2、3、5、7和9個月齡和野生型（WT）小鼠在2個月齡（n=4-8）的辨別學習能力的試驗中，為獲得80%的成功所用的104秒時間的變化。

C. 5XFAD轉基因(Tg)小鼠和野生型小鼠在2、3、5、7、9月齡腸道菌群在屬水平的腸型分析.

D. 不同時間點5XFAD轉基因(Tg)小鼠和野生型小鼠腸道菌群組成的主成分分析.

E. 5XFAD轉基因(Tg)小鼠在不同月份腸道菌群中基於out水平的丰度變化.

G. 5XFAD轉基因(Tg)小鼠在2、3、5、7和9個月時（n=4-8）全腦勻漿中檢測到激活的M1和M2型小膠質細胞的變化。流式細胞術檢測M1型小膠質細胞（CD45LowCD11b+CX3Cr1+Siglec-H+CD86+）和M2型小膠質細胞（CD45LowCD11b+CX3Cr1+Siglec-H+CD206+），細胞計數與CD45LowCD11b+細胞比例相關。

H. 流式細胞術檢測5XFAD轉基因(Tg)小鼠（紅點和線）和野生型(WT)小鼠（黑點和線）不同時間點全腦勻漿中浸潤細胞（CD45high）的比例變化.

I. 5XFAD轉基因(Tg)小鼠CD45highcells在不同時間點（n=4-8）的變化。

J. 流式細胞術檢測XFAD轉基因(Tg)小鼠（紅點和紅線）2、3、5、7和9個月時全腦勻漿中浸潤性CD4 T細胞（CD45highCD4+）的變化.

K. 5XFAD轉基因(Tg) 在第2、3、5、7、9月全腦勻漿中TH1、TH2細胞浸潤的變化.

L. Th2/M2相關分期和Th1/M1相關分期中早期和晚期（2-3個月和7-9個月）腦淋巴細胞比例的趨勢變化與腸道菌群在屬水平上的丰度的相關性分析.

2 腸道菌群是大腦免疫細胞浸潤和小膠質細胞激活所必需

為了確定腸道菌群變化是否能驅動外周免疫細胞浸潤以及AD進展中的神經性炎症，研究者使用了含有氨苄西林(0.1 mg/mL)、鏈黴素(0.5 mg/mL)和粘菌素(0.1 mg/mL)處理，消除腸道菌群的影響。在Tg小鼠中進行抗生素處理導致腸道微生物丰度顯著減少(圖2A)。隨著這種變化，研究者觀察到大腦內浸潤的促炎Th1細胞(圖2B)和M1細胞(圖2C)也逐漸減少。此外，這些發現得到了同籠飼養實驗的證實，其中WT小鼠與同齡的Tg小鼠從出生起共住了7個月，共同居住的WT小鼠表現出與Tg小鼠相當的辨別學習能力下降，表明長期暴露於Tg細菌可能導致認知障礙。對這些小鼠腸道菌群變化的分析表明，共同居住的WT小鼠和Tg小鼠之間腸道微生物區系的組成非常相似，但與單獨居住的同齡WT小鼠的腸道微生物區系組成明顯不同(圖2D)。此外，共同居住的WT和Tg小鼠之間的Th1細胞浸潤也具有可比性，兩者都顯著高於單獨居住的WT小鼠(圖2E)。同時，M1細胞在共同居住的WT小鼠中僅略有增加(圖2F)，表明微生物區系的變化主要影響浸潤的免疫細胞而不是常駐的免疫細胞，這些結果表明腸道微生物變化在AD進展過程中可以驅動外周免疫細胞浸潤和神經炎性激活。

圖2腸道菌群是免疫細胞浸潤和小膠質細胞活化所必需的。

A. 口服抗生素5個月對7月齡5XFAD轉基因(Tg)小鼠腸道微生物相對丰度的影響.

B/C. 口服抗生素5個月對7月齡5XFAD轉基因(Tg)小鼠腦勻漿th1細胞（B）和m1型小膠質細胞（C）比例的影響.

D. 野生型、同籠飼養型和5XFAD轉基因(Tg)小鼠腸道菌在屬水平的相對丰度變化.

E/F. 7月齡WT、同籠飼養型WT和5XFAD轉基因(Tg)小鼠腦勻漿中TH1細胞（E）和M1型小膠質細胞（F）比例的變化.

G. 用細胞因子抗體芯片檢測7月齡WT、同籠飼養型WT和5XFAD轉基因(Tg)小鼠腦勻漿中細胞因子的水平變化。

在研究中，該團隊揭示了腸道微菌群在AD進展中的重要作用，並提示腸道微生物干預的潛在治療意義。為了驗證這一假設，研究者採用GV-971(圖3A)，在9個月大的APP/PS1小鼠中，研究其對認知障礙的改善作用。實驗發現，GV-971在APP/PS1小鼠中，可增強在Morris水迷宮任務中的訓練試驗(圖3B)和探測試驗(圖3C)中的空間學習和記憶能力。同時，GV-971也顯著改善了小鼠在Y迷宮中的表現(圖3D)。最近，GV-971在中國一項為期36周的多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的第三期臨床試驗中顯示了其對逆轉AD患者認知功能障礙的治療效果。由於碳水化合物以單糖或寡糖形式存在時，是細菌的主要營養來源，並對菌群顯示出不同的調節作用，因此研究者後續試圖探討GV-971是否會對腸道微生物有所影響。

圖3 GV-971對APP/PS1小鼠行為學改變的影響。

A. GV-971的結構, GV-971是一種聚合度從二聚體到低聚體的酸性線性低聚寡糖混合物，平均分子量約為1KDa。

B. Morris水迷宮（Morris Water Maze, MWM）實驗對APP/PS1小鼠空間學習記憶的逃避潛伏期測定。

C. MWM實驗中平臺位置交叉次數對APP/PS1小鼠空間學習記憶的影響。

D. 用Y迷宮測試APP/PS1小鼠空間工作記憶的準確性。

4 GV-971通過塑造腸道菌群從而減輕神經炎症

從7月齡開始口服GV-971一個月之後的Tg小鼠，可以發現其腸道菌群的組成有了顯著地雙向變化(圖4A)。與腸道菌群結構變化相一致，GV-971在Tg小鼠中的治療，打破了先前觀察到的腦淋巴細胞和腸道細菌變化之間的相關性(圖4C)，即減少大腦Th1細胞的比例(圖4D)，顯著減少小膠質細胞激活(圖4E)，並降低多種腦細胞因子水平(圖4F)。同時，GV-971的處理也顯著減少了Aβ蛋白斑塊的沉積以及tau磷酸化，並改善了Tg小鼠辨別學習能力的下降(圖4G-I)。

研究者進一步進行菌群移植實驗，將GV-971處理的Tg小鼠的糞便移植到受體C57BL/6 WT小鼠。研究發現，與未經GV-971處理的Tg小鼠相比，GV-971處理的Tg小鼠的糞便導致受體小鼠腦組織中的Th1細胞減少(圖3)。與此同時，抗生素處理削弱了GV-971對APP/PS1小鼠模型中腸道菌群結構，Th1細胞，IBA1水平和細胞因子表達的影響。此外，用GV-971的一種異構體寡聚古羅糖醛酸 (oligo-guluronic acid, PG)或用聚甘露酸硫酸鹽、聚古魯酸硫酸鹽、肝素、硫酸肝素處理均未顯示治療效果，表明GV-971的糖骨架可能解釋了其對腸道菌群的特定影響。以上結果提示，GV-971可通過調節腸道菌群失調來減輕神經性炎症和認知功能下降。

圖4 GV-971通過修復腸道菌群減輕神經炎症.

A. 基於bray-curtis距離的5XFAD轉基因(Tg)小鼠和GV-971處理的7月齡Tg小鼠腸道微生物在OTU水平上的PCoA分析.

B. 5XFAD轉基因(Tg)小鼠和GV-971處理的7月齡Tg小鼠腸道菌群在屬水平的顯著差異的熱圖分析.

C. 7月齡5XFAD轉基因(Tg)小鼠灌胃GV-971前（左）後（右）腸道菌群（以紫色圓圈附近的數字表示）與腦淋巴細胞（其他彩色圓圈）的相關性變化.

D. GV-971對7月齡5XFAD轉基因(Tg)小鼠腦TH1細胞比例的影響（n=5-7）。TH1細胞計數（CD45highCD4+CXCR3+）與流式細胞儀檢測的CD45highCD4+ T細胞計數相關.

E. GV-971對7月齡5XFAD轉基因(Tg)小鼠海馬體IBA1免疫熒光染色陽性信號表達的影響.

F. GV-971對7月齡5XFAD轉基因(Tg)小鼠腦勻漿細胞因子蛋白水平的影響.

G. GV-971對7月齡5XFAD轉基因(Tg)小鼠海馬Aβ陽性區（G）和tau陽性區（H）的影響.

H. GV-971對7個月大（n=10-13）5XFAD轉基因(Tg)小鼠辨別學習能力評估試驗中獲得80%成功所需時間的影響.

5 GV-971通過調節氨基酸代謝抑制神經炎症

近年來，相關研究突出了腸道微生物相關代謝物在影響宿主免疫系統中的作用。為了驗證上述代謝物可能參與免疫調節，研究者將7月齡Tg 小鼠體外培養的糞便上清添加到naïve CD4+ T細胞培養中，刺激naïve CD4+ T細胞分化為Th1和Th2細胞。相反，GV-971處理的Tg小鼠糞便上清液可以抑制Th1分化，促進Th2分化。接下來，研究者採用非靶向代謝組學技術來表徵糞便代謝組。從WT，Tg和GV-971處理的Tg小鼠的糞便樣本中鑑定出總共11289種代謝物。在與數據庫匹配的那些代謝物中，與WT小鼠相比，Tg小鼠中有124種代謝物的丰度發生了顯著變化。這些改變的代謝物被進一步用Human Metabolome Database和Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes數據庫進行比對註釋，產生總共31種代謝物，這些代謝物在WT，Tg和GV-971處理的Tg小鼠之間有差異變化，使用MBROLE或MetaboAnalyst對上述代謝物的途徑富集分析，進一步揭示了氨基酸相關代謝途徑和酶的顯著變化，特別是

使用隨機森林算法對這些氨基酸進行分類，苯丙氨酸排序為在WT和Tg之間不同的首位，其次是異亮氨酸、5-羥色胺、組氨酸和乙酰鳥氨酸(圖5B)，上述結果提示它們與疾病進展密切相關。接下來，研究者檢測了GV-971處理或未處理的Tg小鼠糞便和血液樣本中所選氨基酸的濃度，並將其與WT小鼠進行了比較。結果發現，Tg小鼠糞便中苯丙氨酸和異亮氨酸的濃度明顯高於WT小鼠，而GV-971處理顯著降低了它們的濃度，使其濃度與WT小鼠相當(圖5C)，同時在血液中檢測到苯丙氨酸和異亮氨酸濃度的類似變化(圖5D)。為了驗證這些氨基酸的升高是否是腸道菌群結構的變化引起的，研究者在FMT研究中同樣檢測了上述氨基酸的濃度。發現，2月齡WT小鼠的糞便可以顯著降低Tg小鼠體內苯丙氨酸和異亮氨酸的濃度。同樣，在不同月齡的共同飼養的WT小鼠中，血液中苯丙氨酸和異亮氨酸濃度也升高，與Tg小鼠相當。

與此同時，為了評估苯丙氨酸和異亮氨酸對T細胞分化的直接影響，研究者將naïve CD4+ T細胞暴露於苯丙氨酸或異亮氨酸或GV-971共同處理4天，並用流式細胞術檢測TH1細胞比例變化。實驗結果發現，暴露於苯丙氨酸或異亮氨酸的Th1細胞分化明顯增強，而這種作用可以被GV-971處理抑制

圖5. GV-971通過控制氨基酸代謝抑制神經炎症.

A. 基於MBROLE對7月齡5XFAD轉基因(Tg)小鼠腸道代謝產物的途徑富集分析.

B. 根據ROC曲線分析，隨機森林模型中最重要的血液氨基酸列表在WT(2m-9m)和Tg(2m-9m)組之間從最重要到最不重要排序。紅色表示高濃度，綠色表示低濃度.

C. 7月齡WT、5XFAD小鼠(Tg)和GV-971處理的TG小鼠(100 mpk)糞便中組氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸含量的變化(n=6-11).

D. 7月齡WT、5XFAD小鼠(Tg)和GV-971處理的TG小鼠(100 mpk)血液中組氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸水平的變化(n=6-7).

E. GV-971對苯丙氨酸和異亮氨酸誘導的naïve CD4+ T細胞(Th0細胞)向Th1細胞分化的影響.

F. GV-971對苯丙氨酸和異亮氨酸誘導的Th1細胞增殖的影響。用CellTrace染色Th1細胞，在苯丙氨酸(1mM)和異亮氨酸(1 mM)存在下用GV-971連續培養4天.

G. C57小鼠腹腔注射苯丙氨酸和異亮氨酸注射液4天后Th1細胞變化比例.

H. 健康對照(HC)和AD患者輕度認知損害(MCI)中氨基酸變化的隨機森林分類分析.

I. 健康對照(HC)和AD患者輕度認知損害(MCI)患者血液中Th1細胞的比例分析.

J. 健康對照組(HC)和AD患者輕度認知損害(MCI)患者血液中苯丙氨酸和異亮氨酸水平變化.

結論

本研究發現，腸道菌群失調和氨基酸衍生的代謝物對特定類型免疫細胞的浸潤非常重要，而這些特定類型免疫細胞的異常浸潤則可以導致AD進展過程中的相關神經炎症。同時，該研究發現GV-971能穿過血腦屏障，通過多位點、多片段地捕獲Aβ蛋白，抑制其過度沉積，同時可以調節腸道菌群平衡，抑制菌群代謝產物特別是苯丙氨酸和異亮氨酸的產生，減輕外周與中樞炎症，從而改善AD進展過程中的認知功能障礙。

圖6. AD進展期腸-腦軸示意圖及干預策略。

隨著Aβ蛋白的沉積和tau磷酸化，在AD進展過程中腸道菌群的改變導致代謝紊亂。同時，異常代謝物的產生可以引發外周炎症，增加腦內與M1小膠質細胞相互作用的免疫細胞的浸潤，導致病理性神經炎和認知障礙(左圖)。口服GV-971重塑腸道菌群，降低紊亂的代謝物產生，從而減少外周免疫細胞向大腦的浸潤，減輕神經炎症，並減少Aβ蛋白的沉積和tau磷酸化，最終可以改善認知功能(右圖)。

評論

阿爾茨海默症，俗稱老年痴呆症，是一種發病進程緩慢的神經退行性疾病。儘管人們在過去的幾十年中對治療阿爾茨海默病付出了巨大的努力，我們仍然見證了基於β-澱粉樣蛋白（β-amyloid, Aβ）沉積和tau蛋白質過度磷酸化的治療手段在晚期臨床試驗中失敗，這也推動了對這種複雜疾病的新治療策略的重新思考。近年來，大量研究表明腸道菌群與宿主先天免疫系統和適應性免疫系統之間存在著動態的相互作用。腸道菌群的失調可能危害宿主的免疫反應，從而促進各種炎症性疾病的發生。隨著全世界科學家研究的不斷深入，腸道菌群紊亂與一系列神經系統疾病的關聯性也越來越清晰。因此，針對這些神經系統疾病，研究者的目光已逐步從靶向中樞神經系統轉移到靶向腸道菌群或者腸道免疫特徵的研究上來。其中，在動物和人體隊列研究中的最新發現也證實了腸道菌群失調與阿爾茨海默病進展過程中小膠質細胞活化二者之間的關聯。

然而，目前針對AD進展中腸道和大腦之間的聯繫機制的理解仍然非常有限，研究者尚不清楚究竟是哪種類型的免疫細胞浸潤在AD的發展過程中發揮主要功能，以及促使外周免疫細胞浸潤大腦，導致局部神經炎症增強的潛在驅動力也尚不清楚。此外，隨著人們對腸道菌群代謝物的研究不斷深入，瞭解在AD進展中與腸道菌群和腦神經炎症相關的特定代謝物是十分必要的。基於此，研究者旨在探討腸道微生物群與AD進展之間的機制聯繫，並探討潛在的干預策略。為此，研究者闡明瞭AD發展不同階段腸道菌群動態變化與神經炎症的關係，首次揭示了AD腸道菌群失調誘導大腦神經炎症的具體分子機制。更為重要的是，本文還同時驗證了該團隊研發的治療AD原創新藥GV-971，一種酸性線性寡糖的混合物，其分子量從二聚體到十聚體不等(分子量可達~1 kDa)，對AD轉基因小鼠認知功能障礙的改善作用。首次從機制層面具體闡述了GV-971對AD產生療效的原因，其通過重塑腸道菌群平衡狀態，降低腸道菌群代謝產物特別是苯丙氨酸和異亮氨酸的產生，減少外周及中樞炎症，減少腦內Aβ蛋白的沉積和tau過度磷酸化，從而顯著改善認知功能障礙。上述研究為闡明AD的發病機制提供了全新的研究思路，也為抗AD藥物的研發提供了重要參考。

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關鍵字: 高峰 寡糖 阿爾茨海默病