LoopRT miRNA cDNA第一链合成试剂盒（茎环法）

实验原理：

采用茎环结构的逆转录引物与 miRNA 分子的 3’端结合， 并在逆转录酶的作用下进行反应， 获得人为加长的miRNA cDNA 第一链。 获得的逆转录产物可直接用于后续的荧光定量检测。 此方法特异性高只对成熟的 miRNA 进行反转，不受其前体干扰， 序列高度同源的 miRNA 也可精确区分。 简化的试剂缩短了操作时间， 一定程度上避免操作过程 RNA 的降解。 本方法通过体系优化， 可实现一次能针对多至 10 种的 miRNA 进行同时逆转录， 使得茎环引物法 miRNA cDNA第一链合成在特异性强、 成本低等优点的基础上， 进一步提升了检测效率和通量。

注意事项：

1. 操作时使用新手套。 使用无 RNase 的一次性塑料制品和枪头避免交叉污染。 配制反应溶液应使用无 RNase 的水。

2. RNA 提取以及后继续处理过程中务必使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿。 玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 h， 塑料器皿
建议尽量使用无 RNase 的一次性塑料制品。

3. 所有从冷冻状态的组分使用前必须完全融化并多次颠倒混匀， 然后短暂离心后备用。

操作步骤：

1. miRNA stem-loop RT primer 及 RT PCR primer 设计方法：

1) 茎环引物由两部分构成。 一部分是通用的茎环结构序列（通用序列有很多种， 本说明书仅列举一种）， 另一部分是针对某个 miRNA 的特定序列， 一般修改其 3’末端的 6-10 个碱基。 具体选用的碱基数量需考虑 3’末端的 GC 含量来决定， 要使其 GC 含量占比超过 50%。 通用茎环结构序列为： 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC-3’
2) 例如设计 hsa-miR-30b-5p（TGTAAACATCCTACACTCAGCT） 的 stem-loop RT primer， 在通用茎环序列后加上 miRNA 的 3’末端 9 个碱基的反向互补序列经验证是好用的。 序列为： 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGCTGAGTGT-3’

2. 反转录体系的配制： 解冻 5×Loop Mix for miRNA 和 RNase-Free H2O， 在 RNase Free 的反应管内按下表配制总体积为20 μl 的反应体系并混匀。 （Loop RT Enzyme 取出后若久置， 请置于冰上， 使用后尽快放回-20℃保存）

试剂组分 体积 终浓度

Total RNA* --- 可达 2 μg
5×LoopRT Mix for miRNA 4 μl 1×
Loop RT Enzyme 1 μl --
stem-loop RT primer（10μM each） ** 1 μl --
RNase-Free ddH2O 补至 20 μl
* 使用Total RNA模板时须确保含有miRNA， Total RNA建议加入0.5-2μg。 若使用miRNA作为模板， 建议加入量为4-8 μl（也可根据目的miRNA丰度确定模板用量）； 是对于低丰度miRNA样品 (如血浆等样品提取的游离RNA)， 可直接加入最大体积14 μl。** 合成的stem-loop RT primer干粉需先溶解到100μM， 然后用RNase-Free H2O稀释混合成10μM each的RT primer混合物备用

37℃ 50℃ 80℃ 20℃ 5 min
30 min
10 min
10 s

4. 合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存； 也可以直接进行下游荧光定量检测。 在进行下游荧光定量检测时， 为避免逆转录体系对定量PCR反应的抑制， 得到最适的Ct值(15-30之间)， 建议将cDNA反应液稀释10-1000倍后使用。注意： 进行后续QPCR检测反应时， 直接逆转录产物作为模板的用量不要多于QPCR 反应体积的1/20， 否则可能会对PCR反应产生一定抑制 。

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