LoopRT miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（莖環法）

實驗原理：

採用莖環結構的逆轉錄引物與 miRNA 分子的 3’端結合， 並在逆轉錄酶的作用下進行反應， 獲得人為加長的miRNA cDNA 第一鏈。 獲得的逆轉錄產物可直接用於後續的熒光定量檢測。 此方法特異性高只對成熟的 miRNA 進行反轉，不受其前體干擾， 序列高度同源的 miRNA 也可精確區分。 簡化的試劑縮短了操作時間， 一定程度上避免操作過程 RNA 的降解。 本方法通過體系優化， 可實現一次能針對多至 10 種的 miRNA 進行同時逆轉錄， 使得莖環引物法 miRNA cDNA第一鏈合成在特異性強、 成本低等優點的基礎上， 進一步提升了檢測效率和通量。

注意事項：

1. 操作時使用新手套。 使用無 RNase 的一次性塑料製品和槍頭避免交叉汙染。 配製反應溶液應使用無 RNase 的水。

2. RNA 提取以及後繼續處理過程中務必使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿。 玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 h， 塑料器皿
建議儘量使用無 RNase 的一次性塑料製品。

3. 所有從冷凍狀態的組分使用前必須完全融化並多次顛倒混勻， 然後短暫離心後備用。

操作步驟：

1. miRNA stem-loop RT primer 及 RT PCR primer 設計方法：

1) 莖環引物由兩部分構成。 一部分是通用的莖環結構序列（通用序列有很多種， 本說明書僅列舉一種）， 另一部分是針對某個 miRNA 的特定序列， 一般修改其 3’末端的 6-10 個鹼基。 具體選用的鹼基數量需考慮 3’末端的 GC 含量來決定， 要使其 GC 含量佔比超過 50%。 通用莖環結構序列為： 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC-3’
2) 例如設計 hsa-miR-30b-5p（TGTAAACATCCTACACTCAGCT） 的 stem-loop RT primer， 在通用莖環序列後加上 miRNA 的 3’末端 9 個鹼基的反向互補序列經驗證是好用的。 序列為： 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGCTGAGTGT-3’

2. 反轉錄體系的配製： 解凍 5×Loop Mix for miRNA 和 RNase-Free H2O， 在 RNase Free 的反應管內按下表配製總體積為20 μl 的反應體系並混勻。 （Loop RT Enzyme 取出後若久置， 請置於冰上， 使用後儘快放回-20℃保存）

試劑組分 體積 終濃度

Total RNA* --- 可達 2 μg
5×LoopRT Mix for miRNA 4 μl 1×
Loop RT Enzyme 1 μl --
stem-loop RT primer（10μM each） ** 1 μl --
RNase-Free ddH2O 補至 20 μl
* 使用Total RNA模板時須確保含有miRNA， Total RNA建議加入0.5-2μg。 若使用miRNA作為模板， 建議加入量為4-8 μl（也可根據目的miRNA丰度確定模板用量）； 是對於低丰度miRNA樣品 (如血漿等樣品提取的遊離RNA)， 可直接加入最大體積14 μl。** 合成的stem-loop RT primer乾粉需先溶解到100μM， 然後用RNase-Free H2O稀釋混合成10μM each的RT primer混合物備用

37℃ 50℃ 80℃ 20℃ 5 min
30 min
10 min
10 s

4. 合成的cDNA反應液可放置於-20℃保存； 也可以直接進行下游熒光定量檢測。 在進行下游熒光定量檢測時， 為避免逆轉錄體系對定量PCR反應的抑制， 得到最適的Ct值(15-30之間)， 建議將cDNA反應液稀釋10-1000倍後使用。注意： 進行後續QPCR檢測反應時， 直接逆轉錄產物作為模板的用量不要多於QPCR 反應體積的1/20， 否則可能會對PCR反應產生一定抑制 。

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關鍵字: 試劑盒 設計 試劑