1簡介
從基礎研究到轉化醫學和診斷學，稀有細胞群體在多個領域中的重要性日益提高。例子包括外周血中的稀有CTC，腫瘤幹細胞，循環內皮細胞，造血祖細胞及其亞群以及母體循環中的胎兒細胞。還包括有檢測轉移性乳腺癌細胞或浸潤骨髓的成神經細胞瘤細胞，監測最小殘留疾病，檢測幹細胞和外周血中罕見的HIV感染細胞，抗原特異性T細胞，不變的自然殺傷T細胞（iNKT）以及遺傳毒理學中突變頻率的分析。也包括多功能測定，例如Ag誘導T淋巴細胞產生不同的細胞因子，增加了在這些T細胞群體中發現稀有細胞的難度。本文圍繞稀有細胞討論，包括所需的樣本量，預富集，要使用的標記物數量和要獲取的細胞總數，排除雙峰的重要性以及使用DUMP通道。
2最優條件
研究稀有細胞需要關注，在所有階段都應採用優化的最佳方法，包括樣品收集，明確定義，合適對照以及強大的軟硬件。術語“稀有”通常是指頻率為0.01％或以下的事件，儘管 文獻中的最稀有記錄仍是1000萬個外周血細胞中摻入1個腫瘤細胞。需要獲取大量事件，高SNR，恰當的閾值，門控和DUMP通道的使用都是最相關的方面。
2.1樣本量
根據所研究的稀有細胞的估計頻率，計算需要的樣本量至關重要。例如，實驗的目的是枚舉腦脊液（CSF）中存在的稀有細胞群，則考慮到只能從患者身上獲得幾毫升樣本，因此理論上應將採集的所有CSF用於實驗。在採集血樣時，還需考慮患者的病理狀況。例如，研究的終點是在感染HIV的患者中體外刺激iNKT細胞後評估其細胞因子的產生，iNKT細胞在外周PBMC中極為罕見(0.01–1％)。為了定義該群體，使用的標記包括CD3，CD4，CD8，iTCR以及細胞活性標記；感興趣的細胞因子如TNF-α，IFN-γ，IL-4和IL-17，一共九種。未採取抗逆轉錄病毒療法的HIV+患者明顯免疫功能低下，CD3+ T淋巴細胞數量少。因此，檢測到合理數量的稀有細胞所需的血液樣本量（根據Poisson統計）可能多達50 mL，還要考慮分為刺激和未刺激兩組進行。
2.2富集和標記的選擇
實驗終點（例如表型，功能測定）決定是否需要預富集，也需明確鑑定稀有細胞群體的標誌物。例如，對循環內皮細胞及其祖細胞的準確定量（如圖36所示），至今尚未就用於鑑定這些細胞的標記物或分析前富集（通過密度梯度，血沉棕黃層和/或磁珠富集）的必要性達成共識 。富集有利有弊，可移除大量非目標細胞，但也會丟失細胞包括目標稀有細胞。可能群體鑑定的完整標記物未確定或統一，應該確定最重要的標記物，以初步鑑定和表徵這些群體。例如，對於iNKT細胞，Vα24Jα18 iTCR可以唯一識別這些細胞。確定好標記物後，即可按照多色方案配色原則來進行方案設計包括：將最亮的熒光染料用於最弱表達的標記，共表達時Spread影響的考量，補償管和FMO對照的設置等。
圖36. 稀有細胞的門控策略示例。門控策略用於識別外周血白細胞中的循環內皮（CEC）及其前體（EPC）細胞。（A）FSC-A/FSC-H圖上去除碎片和聚集體。（B）Time/SSC圖上去除不穩定信號包括堵塞。（C）使用DUMP通道去除CD45+和死細胞。（D）基於Syto16+鑑定出有核細胞。（E）根據CD34+鑑定幹細胞，（F）鑑定EPC（CD133+，CD31+）和CEC（CD133-，CD31+）。對每個亞群評估了CD276（也稱為B7-H3）（G，I）和CD309（H，J）（也稱為VEGFR-2或KDR）的表達。此例獲取了超過一千萬個事件，以分析小於0.1％的稀有群體。
2.3獲得的事件數
關於需要獲取的事件數量，建議使用泊松統計，它定義了給定數量的事件將在固定的時間/空間間隔內發生的概率，假設這些事件將以已知的平均速率發生，與從先前事件經過的時間無關。對於流式的稀有細胞檢測：N為總事件數，R為目標細胞如陽性細胞數，P為目標細胞比例，則為P = R / N，0≤P≤1。方差定義為：Var（R）= NP（1- P）。標準差SD是方差的平方根，CV是等於1/SD即1 /Var的平方根*100%。應用舉例，如檢測PBMC中的B細胞，健康個體中，CD19+B細胞比例為10％左右，因此：P = 0.1，N=5000時，計算得CV=4.71％，一般建議CV保持在5％以下，因此獲得5 000個事件也已足夠。若獲取10000個總事件，則CV=3.33％。保持達到一定的CV值，目標細胞比例越低，需要獲取的總事件數越多。更詳細內容請參閱本公眾號之前文章“流式實驗中泊松分佈對稀有細胞檢測和分選的啟發”。
表6. 0.01％的稀有細胞群體的事件數量示例。
實際還是會發生不能滿足CV要求，獲取到的目標門內細胞數量非常少的情況，如何判斷這群細胞是否真正意義上的目標細胞，Mario Roederer給出了一些建議：若能排除此類陽性事件存在的其他解釋如死細胞、碎片引起的噪音或體外靶標激活前體內T細胞活化引起的變化等，則無論事件數量如何，都可以將其視為陽性。因此，沒有理由為事件數量確定閾值，在該閾值以下就將其視為陰性結果。當然要求實驗設計科學合理，對照科學嚴謹，結果統計準確。
2.4樣品濃度和流速
由於獲取大量事件以檢測稀有細胞群至關重要，因此樣品濃度和流速是關鍵參數，通常可以縮短採集時間。但是，必須小心，如果流式細胞儀使用流體動力學聚焦（這是目前大多數市售流式細胞儀中使用的系統），則增加流速會導致樣本流寬度的增加，從而導致更高的CV。
2.5閾值，門控和DUMP通道
應選擇合適參數或組合作為閾值，以有效扣除雜信號保留感興趣的群體，更詳細內容請參閱本公眾號之前文章“【基礎】閾值”。最大化感興趣群體的SNR。設門排除死細胞，雙峰/聚集體/碎片和所有不需要的細胞群，強烈建議使用“ DUMP”通道包含多個可識別無關細胞的抗體或染料。另使用Time/關注參數的點圖消除採集過程中由於堵塞或其他瞬態問題引起的異常事件。儀器應保持清潔，並且必須在採集不同樣品之間清洗進樣針，以最大程度地減少樣品汙染和可能的假陽性事件。
3數據分析
最後，數據分析需要足夠強大的軟件和硬件（8GB RAM或更高），因為所獲取的數據文件往往很大，這取決於已獲取的事件和參數的數量（例如，在一千萬個事件中有10種顏色和2種散射光信號）。為了最小化文件大小，在獲取時勾掉不需要的參數，設置恰當的閾值。總之，流式細胞術是目前解決稀有細胞分析的最有效技術，而所謂的“下一代”儀器具有很高的速度和靈敏度，已經使得對這些細胞的檢測和分析變得容易。
本公眾號另一篇關於稀有細胞的文章搜索可讀：【基礎】改善稀有細胞檢測需要考慮的幾種因素。
以上內容若有不妥敬請指正。
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