2017年9月4日，国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Scientific Reports》杂志在线发表了中国科学院上海巴斯德研究所病原诊断中心张驰宇研究员的一篇研究论文，研究建立了一种基于高保真酶和HF探针的新型荧光定量方法，有效地解决了高变异对病毒诊断的影响，极大地突破了病毒性传染病诊断的最大瓶颈，使病毒检测的灵敏性和广谱性得到了大幅度的提升。研究结果题为“A novel quantitative PCR mediated by high-fidelity
DNApolymerase”(一种高保真酶介导的新型荧光定量方法)。研究生张梦玲为论文第一作者，张驰宇研究员为论文通讯作者。传染病严重威胁人类健康，超过70%的新发突发传染病由病毒造成。与其他病原体相比，病毒最大的特点在于其高变异性，这成为病毒检测的最大挑战。高变异会严重干扰检测结果的准确性、影响检测的灵敏度、增加引物和探针的设计难度。因此较难获得高变异病毒的高广谱和高灵敏的检测方法。现有的PCR、qPCR及各种恒温扩增方法(如LAMP，RPA等)均不能很好解决病毒高变异性对检测的影响。
为了解决高变异对病毒检测影响的问题，研究组建立了一种基于高保真酶的新荧光PCR方法。该方法使用HFman探针，依赖高保真聚合酶的3’-5’外切酶活性，可以高效切除探针3’荧光标记的碱基，启动扩增。无论探针(或引物)3端是否存在与模板的错配，聚合酶均可以高效地启动扩增，不受错配影响，因此可以容忍突变模板(图1)。与传统TaqMan探针法相比，该方法只需要一个HFman探针和一条对应引物，设计相对简单。为了验证方法的可靠性，我们建立了HIV-1病毒载量测定的方法。为了检测方法的灵敏性和可靠性，我们选择了21个HIV阳性的临床样品(覆盖高、中和低病毒载量)，同时用新方法和罗氏的最新款HIV-1病毒载量试剂盒(COBAS® AmpliPrep /COBAS® TaqMan® HIV-1 Test,v2.0)进行了比较，结果显示新方法与罗氏的试剂盒检测结果具有很好的一致性(图2)，表明了新方法和HIV-1定量检测方法具有良好的商业化开发前景。
图1.原理图
图2. HIV-1病毒载量检测方法及罗氏试剂盒比较.(a和b)标准曲线(HIV-1 RNA：107-100copies/ul);(c和d)与Roche HIV-1 kit的比较
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原文摘要：
The biggest challenge for accurate diagnosis of viral infectious disease is the high genetic variability of involved viruses, which affects amplification efficiency and results in low sensitivity and narrow spectrum. Here, we developed a new simple qPCR mediated by high-fidelity (HF) DNA polymerase. The new method utilizes an HFman probe and one primer. Fluorescent signal was generated from the 3′–5′ hydrolysis of HFman probe by HF DNA polymerase before elongation initiation. Mismatches between probe/primer and template have less influence on the amplification efficiency of the new method. The new qPCR exhibited higher sensitivity and better adaptability to sequence variable templates than the conventional TaqMan probe based-qPCR in quantification of HIV-1 viral load. Further comparison with COBAS TaqMan HIV-1 Test (v2.0) showed a good correlation coefficient (R2 = 0.79) between both methods in quantification of HIV-1 viral load among 21 clinical samples. The characteristics of tolerance to variable templates and one probe-one primer system imply that the probe/primer design for the new method will be easier and more flexible than the conventional method for highly heterogeneous viruses. Therefore, the HF DNA polymerase-mediated qPCR method is a simple, sensitive and promising approach for the development of diagnostics for viral infectious diseases.
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