Electron micrograph of CaMV
（en.wikipedia.org/wiki/Cauliflower_mosaic_virus）
我們都知道，無論是植物、動物、微生物還是人類，基本上每個基因都有屬於自己特異的啟動子。簡單來說，啟動子就是位於基因上游的一段DNA序列，它可以調控基因的表達。不同的啟動子具有不同的活性，特異調控基因在何時、何地以及以多少量表達。在“植物啟動子圈兒”有一位明星級別的啟動子幾乎無人不知，那就是35S啟動子。有意思的是，這個在植物生物技術中廣泛應用的啟動子的“出身”並不好，它並沒有正統高貴的植物家族血統，卻來自於一種臭名昭著的植物病毒。你一定很好奇，這種戲劇性的大逆轉是如何發生的呢？接下來，就讓我們一起來回顧一下這段讓人驚奇而又有趣的歷史吧。
花葉病毒（1921-1937）
嚴格來說，35S啟動子應該叫做CaMV 35S啟動子。CaMV是Cauliflower Mosaic Virus的縮寫，翻譯成中文是花椰菜花葉病毒。有趣的是，CaMV最早並不是在花椰菜中發現的，而是於1921年首先在大白菜（Chinese cabbage）上發現。感染了這種病毒的植物葉片表面出現類似馬賽克的壞死斑痕，因此被稱為花葉病毒（Mosaic Disease）。在接下來的幾年裡，這種病毒也逐漸在大頭菜（turnip）和雪菜（pot-herb mustard）上發現。可是，當時並沒有引起人們太大的關注。直到十幾年後，美國中西部地區圓白菜（cabbage）農田中蚜蟲肆虐，導致CaMV的大爆發，對農業生產造成了重大損失。與此同時，美國加州的花椰菜上也發現了類似的馬賽克壞死斑。而直到此時，CaMV才開始引起科學家們的注意，他們從此才開始投入更多的時間和精力，去研究這位造成重大農業生產巨大損失背後的兇手。
1937年的一項研究表明，被CaMV感染的花椰菜可以把病毒傳染給51種不同的蔬菜類植物，比如西藍花（ broccoli）、捲心菜（ cabbage）、羽衣甘藍（kale）、大頭菜（ turnip）、甘藍（kohlrabi ）以及大白菜（ Chinese cabbage）。有意思的是，這些植物全都屬於十字花科。另外，研究人員還發現了至少三種以花椰菜為食的蚜蟲，可作為CaMV的傳播媒介。由於這一開創性的研究以花椰菜中的mosaic virus為研究對象，於是從此開始，這種病毒就逐漸以Cauliflower Mosaic Virus的名字被大家所接受。
菸草花葉病毒（1937-1978）
在1940s晚期，對於CaMV的研究在歐洲達到了一個高潮。在當時，由於受CaMV的影響，英國的花椰菜和西藍花生產損失慘重。而此時第二次世界大戰才剛剛結束，食物短缺，CaMV的爆發無疑是雪上加霜。科學家們立刻對CaMV啟動了緊急研究，很快取得了重大進展。他們發現CaMV是一種非循環（non-circulative）非持久（non-persistent）的病毒，也就是說，它們並不會進入昆蟲媒介體內，而只是進入蚜蟲的口針中，並通過蚜蟲的刺吸在植物間傳染。有意思的是，後來2007年的一項研究表明，CaMV只存在於蚜蟲口針遠端的一個大概長為5μM寬為1μM的區域。
1960s的一項研究發現，CaMV是第一個被鑑定的雙鏈DNA植物病毒。這具有非常重要的意義，因為這是病毒DNA可以在植物細胞中成功轉錄的先決條件。另外，這也是CaMV作為副反轉錄病毒（pararetrovirus，相對於大家所熟知的單鏈RNA反轉錄病毒而言）的第一個證據。1980年，CaMV的基因組公佈，它是一個8024bp的雙鏈環狀DNA分子，預測有6個ORF。從此往後，科學家們才逐漸得以從分子水平解開CaMV侵染植物的秘密。
在1980s早期，科研人員發現，預測的6個編碼區只被轉錄成2個mRNA，一個是比較短的單順反子19S RNA，另一個是覆蓋全基因組的35S mRNA。雖然19S RNA只編碼一個蛋白，但是後來的研究發現，它在抑制宿主植物細胞中的基因沉默過程中發揮了重要作用。35S mRNA是基因組複製的模板，它還可以進一步分割為4個獨立的mRNA。
35S RNA有兩個非常奇怪的特點：（1）雖然它是基因組複製的模板，但它卻比基因組要長，因為在它的5'端和3'端有200bp的重疊；（2）它有一個不太常見的長達600nt的前導序列，可以被轉錄成大量的21到24nt的正義和反義RNA，在侵染過程中作為誘餌，吸引宿主細胞沉默系統的注意力，使真正的35S mRNA順利逃脫。
不過，這一時期最重要的研究進展是發現了19S以及35S mRNA可以在宿主細胞中高丰度表達，這暗示著該病毒可能將它自己的雙鏈DNA插入了植物細胞中，並且這一段插入的病毒DNA包含了在宿主細胞中高峰度起始轉錄的所有因子。
當菸草花葉病毒遇上植物生物技術
（1978-1985）
在1970s到1980s早期，植物分子生物學和遺傳學/基因組學正處於發展初期。在這一階段，擬南芥才剛剛作為一種模式生物被正式接受，植物的遺傳轉化體系還沒有建立，只有極少數的基因被克隆和研究。其中，只有一種可以在植物中發揮作用的啟動子研究的比較透徹，就是細菌的章魚鹼合酶（octopine synthase ）基因啟動子。另外，還有一種來自於豌豆的核酮糖-1,5-二磷酸羧酶（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase）基因啟動子被做了大概的定位。
因此，當科學家們逐漸發現CaMV可以將它們的DNA插入到植物細胞中，並可保持高丰度表達後，他們馬上意識到了CaMV作為遺傳轉化克隆載體特異表達目的基因的潛力。從此開始，對於CaMV的研究主要分為兩大派系：第一派主要研究將外源基因插入到CaMV基因組中後，到底是否能夠插入植物細胞，並在宿主細胞中成功表達；第二派試圖尋找決定CaMV基因在植物細胞中高丰度表達的特定DNA序列。
第一派的科研人員很快就取得了重大進展，他們將細菌和哺乳動物的基因克隆至CaMV的基因組中，證明了這些基因可以成功地插入植物細胞並表達。不過同時，他們也發現了這一體系具有嚴重的先天缺點：CaMV只能成功導入小於250 bp的片段，對於大片段卻無能為力，這就嚴重限制了CaMV遺傳轉化體系的發展和應用。而後來，科學家們建立了更加有效的農桿菌轉化法，CaMV介導的植物轉化在1990s早期逐漸凋亡。不過，相對於第一派的逐漸凋零的結局，第二派的研究就是非常成功了。
CaMV 35S啟動子（1985-2000）
我們現在要研究基因的功能，常用的一個手段就是將基因過表達，觀察轉基因植株的表型有什麼變化。可是在1985年以前，由於轉基因體系還沒有建立，以上這都無法實現。CaMV 35S啟動子的發現，為植物遺傳轉化體系的建立帶來了一線曙光。
為了揭示控制病毒基因在植物細胞中表達的特定序列，科研人員將35S基因啟動子區域1000bp左右的序列進行了不同的刪除，並將它們和人類的hgh（human growth hormone）基因融合，使用農桿菌轉化到植物細胞中。他們發現，35S基因上游的46bp序列可導致最低的表達，而另外一個343bp的序列卻可導致基因在所有檢測的植株組織中都有非常高的表達。於是，這段343bp的序列被命名為“CaMV 35S 啟動子”，而那46bp的序列則被稱為“最小啟動子”。科研人員在後續的研究中還發現，這段343bp序列的功能竟然還有不同的分化，它們分別調控基因在不同組織中的表達，並且它們的功能還可以進行不同的組合和疊加。
基於這些開創性的發現，在隨後的幾年裡，逐漸出現了許多其他版本的啟動子，比如將兩個CaMV 35S啟動子串聯起來會極大地增加基因的表達。另外，46bp的最小啟動子也是一個非常有用的工具。後來，科研人員發現，不同基因啟動子區域中小的調控序列可以被特定的轉錄激活因子結合。受此啟發，科學家們將不同激活因子和最小啟動子結合，發明了使用特異的激活因子激活基因表達的啟動子，這就是我們熟悉的誘導型表達啟動子。使用這種誘導型表達啟動子，可以使我們任意操控基因的表達時期，這在基因功能的研究中具有非常重要的意義。
僅僅在35S啟動子發表後的一年（1986年），研究人員就將35S啟動子驅動的EPSP（ 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase）基因轉化到矮牽牛中。EPSP基因是芳香族氨基酸合成通路中非常關鍵的一個酶，另外它還是除草劑特異的靶標。人們驚奇的發現，過表達EPSP基因的轉基因植株竟然有了除草劑的抗性，這就是人類歷史上第一個抗除草劑轉基因植物。
值得注意的是，35S啟動子的發現，農桿菌介導的植物轉化體系的建立，以及抗除草劑轉基因植物的出現，這三大植物學歷史中里程碑式的研究成果僅僅在三年的時間裡接連發表，這是植物科學共同體以及正處於快速發展階段的植物生物技術領域的巨大飛越。在接下來的二三十年中，35S啟動子成為了植物生物技術領域使用做廣泛的啟動子，並且我們現在種植的所有轉基因植物幾乎都含有35S啟動子。
當今的CaMV 35S啟動子
（2000-今）
時至今日，35S啟動子已然成為植物科學中使用最廣泛的啟動子。不過，由於一些原因，現在35S啟動子的使用卻正慢慢減少。其中，最主要的原因就是，相對於1980s年代，我們現在除了35S啟動子還多了一些其他的選擇。擬南芥的UBIQUITIN10（UBQ10）啟動子在1990s中期被發現，它也是一種非常強的啟動子，並在所有組織中都具有非常高的活性。作為一種具有植物家族出身的啟動子，UBQ10正在越來越多地替代35S啟動子的使用。而科研工作者們也逐漸發現，實際上35S啟動子並不是在所有的組織和細胞中都有活性，而UBQ1或10並沒有這種缺陷。其次，2000年擬南芥基因組組裝和註釋的完成，使人們對擬南芥基因組中所有基因及其調控序列有了比較清楚的瞭解。科學家們可以比較容易地克隆基因，並使用基因內源的啟動子或者組織和細胞特異的啟動子研究基因的功能。再次，矮牽牛花田間試驗中出現的基因沉默現象，啟發科學家們將35S啟動子和p19沉默抑制子連接在一起使用。雖然這可以在一定程度上抑制基因沉默現象的發生，但也使35S啟動子的使用更加複雜。最後，有研究表明35S啟動子不僅可以調控其驅動基因的表達，還會影響臨近基因的表達，這就進一步限制了35S啟動子的使用。因此，雖然現在35S啟動子仍然在科學研究中廣泛使用，但是越來越多的人更喜歡使用內源啟動子和UBQ10啟動子。
在農業生產中，批准種植的轉基因作物中超過80%都含有35S啟動子，比如抗除草劑大豆，轉Bt基因的玉米和棉花，以及抗木瓜環斑病毒的轉基因木瓜。科學研究已經證明這些轉基因作物是安全的，並且人類和牲畜已經食用了數十年，並沒有出現食品安全事件。由於轉基因作物的培育、田間試驗、安全性檢測以及政府的審批極為繁瑣，需要花費大量的時間和金錢，因此在實際的生產中要遷移到使用其他啟動子是一項長期的工程。
不過，在實際生產中，由於專利的問題，35S啟動子的使用仍有諸多限制。這就迫使人們逐漸開始使用其他類似的啟動子，比如玄參花葉病毒35S啟動子（FMV 35S，figwort mosaic virus 34S promoter ）。另外，在單子葉植物，比如水稻和玉米中，35S啟動子的活性並不如在雙子葉植物中那麼強，於是研究人員逐漸越來越多地使用水稻actin1或者玉米Ubi1 啟動子。所以，雖然農業生產中由35S啟動子向其他啟動子轉移的速度比科學研究中慢了許多，但是啟動子的多樣化正在逐漸增加。
時至今日，雖然35S啟動子的使用正在逐漸減少，但是它曾經對整個植物科學以及植物生物技術領域巨大的推動作用是毋庸置疑的。相信真到了蓋棺定論的那一天，35S啟動子必將在植物科學史中留下濃墨重彩的一筆！
注：版權歸原作所有。本編譯版本根據原文完成，為增強可讀性並非原文逐字翻譯。原文信息如下：
Somssich, M. (2018). A short history of the CaMV 35S promoter. PeerJ Preprints.
DOI：10.7287/peerj.preprints.27096v2
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