原创 莫沉 微生态 2019-11-07
导读
住院的部分早产儿由于易受感染，需要长时间接触抗生素。目前尚不清楚抗生素对早产儿肠道菌群和耐药性的短期影响是否会在新生儿重症监护病房出院后持续存在。在本研究中，研究者利用宏基因组学、基于培养和机器学习技术来研究住院期间和住院后暴露于抗生素环境下的早产儿的肠道菌群和耐药性，并将这些数据与同期采样的未接触抗生素的健康婴儿进行比较。研究者发现在接受早期抗生素治疗的早产儿中，其胃肠道中抗生素耐药性持续增强，并且长期携带多药耐药肠杆菌以及具有独特的抗生素驱动的肠道微生物群体和耐药性组装模式，表明接受早期抗生素治疗和住院对早产儿的附带损害是长期的。基于此，研究者在本文中敦促相关机构来共同制定有效的防控策略以减少对生理上极其脆弱的新生儿群体造成的上述不良影响。
论文ID
原名：
译名：早期住院治疗和抗生素治疗对婴儿肠道菌群和耐药性影响的宏基因组特征
期刊：Nature Microbiology
IF：14.3
发表时间：2019.10
通讯作者单位：华盛顿大学圣路易斯医学院
实验内容
1 抗生素对早产儿肠道菌群的影响
为了深入地了解，早产及相关的早期住院治疗和抗生素治疗对早产儿肠道菌群的长期影响，研究者对58名婴儿在出生后21个月的437份粪便样本进行了全宏基因组鸟枪测序分析。
研究者使用MetaPhlAn2推断细菌的分类组成，在所有婴儿中，Shannon多样性在稳定之前的发育阶段有所增加，同时在近足月婴儿中，菌群的Shannon多样性在平台期前的第一个月内迅速增加，而早产儿菌群的多样性增加得更缓慢且变化更大(图1a)。在出生的头几个月里，Enterobacteriaceae和Enterococcaceae在早产儿肠道中占主导地位。相比之下，在足月的婴儿中Enterobacteriaceae的早期定殖先于Bifidobacteriaceae的强健定殖(图1b)。与早产儿相比，Enterococcaceae在生命早期(<4个月时龄)在足月儿中明显少于早产儿(P<0.001)，而早产儿的Prevotellaceae在婴儿期后期(>8个月时龄)的丰度也同样低于早产儿(P<1×10−10)。尽管存在上述差异，研究者还是发现了如HUMAnN2所推断的，肠道菌群随时间和组间的预测功能稳定性(图1c)。此外，在校正多重比较后，研究者还发现生存天数与Shannon多样性增加显著相关(P<0.001)，而近期(样本采集后30天内)使用万古霉素(P<0.001)，氨苄青霉素(P<0.001)，美罗培南(P=0.009)或头孢吡肟(P=0.012)则与多样性降低显著相关(图1d)。在该队列中，前一个月接受一个以上疗程抗生素治疗的婴儿中，肠道菌群的Shannon多样性显著降低(图1e)。因此，近期的抗生素治疗似乎是生命早期决定菌群多样性的关键驱动因素之一。
图1 临床变量预测微生物多样性和组成.a.本研究中所有近足月(n = 17)和早产儿(n = 41)的Shannon多样性；b.由MetaPhlAn2推断的所有近足月(n = 17)和早产儿(n = 41)婴儿的菌群种类和功能；c.由HUMAnN2推断的所有近足月(n = 17)和早产儿(n = 41)的菌群种类和功能；d，生存期与菌群Shannon多样性的增加显著相关，而取样前一个月内万古霉素、氨苄西林、美罗培南或头孢吡肟处理与物种丰富度显著降低相关。以受试者为随机效应的广义线性混合模型。苯唑西林被包括在模型中，但在多重比较校正后并不显着；e. Shannon多样性在过去一个月中接受多于一个疗程抗生素治疗的婴儿明显低于在此期间未接受抗生素治疗的婴儿, 使用双侧Wilcoxon秩和检验进行统计分析，并进行Benjamini-Hochberg校正。
2 新生儿重症监护室出院后菌群可以得到部分恢复
尽管早产儿菌群的分类组成按出生时的胎龄和抗生素治疗状态有显著聚集(Adonis test，P<0.001，Bray-Curtis Distance)，但是按时间顺序的年龄是所有婴儿菌群组成的主要驱动因素(图2a)。为了量化这种扰动的程度，研究者使用随机森林来分析婴儿菌群中物种的相对丰度与他们的时间年龄的关系。准确预测所需的最小变量数为50(图2b)。因此，研究者训练了一个由50个关于足月婴儿子集的最具信息的预测因子组成的模型，以模拟健康的菌群发育体系，并随后对该模型进行了改进和验证。
图2 新生儿重症监护室出院后早产儿肠道菌群的部分结构恢复. a. 早期仅使用抗生素治疗的早产儿和早期和随后进行抗生素治疗的早产儿之间的菌群组成是不同的(Bray-Curtis Distance；P
3 早产儿肠道菌群的耐药性
我们对具有耐药性的宏基因组插入片段进行了测序，并组装了874个特异基因。这些功能筛选的抗生素耐药相关基因对NCBI非冗余蛋白数据库的识别中值为94.4%，而对综合抗生素耐药性数据库(Comprehensive Antibiotic Resistance Database,CARD)条目的识别中值为32.0%(图3a)。因此，尽管在我们的功能选择中发现的大多数抗性决定因素已经被预先排序，但它们往往没有被分配抗性功能。赋予开放阅读框架(open reading frames, ORF)的预测抗药性来源(由NCBI非冗余蛋白数据库中的最佳BLAST结果确定)主要是未培养的细菌或Enterobacteriaceae (图3b)。在婴儿肠道菌群中鉴定Enterobacteriaceae可能是生素耐药相关基因的宿主，这与目前对Enterobacteriaceae是抗生素耐药相关基因的多产宿主的理解是一致的。研究者使用ShortBRED扩展了其对于抗性组的分析，以量化所有测序的Metagenome中翻译的抗生素耐药相关基因的丰度，该数据库包括来自CARD的所有抗生素耐药相关基因以及这里确定的功能选择的抗生素耐药相关基因。抵抗体根据出生时的胎龄和抗生素治疗状态聚类(图3c；P<0.001，Adonis test)。
图3 早产儿的肠道菌群有较强的耐药性. a. 所有功能性筛选的耐药基因及其在综合耐药数据库中的最高匹配度与在NCBI非冗余蛋白数据库中的最高匹配度之间的氨基酸同源性，后者由用于选择的抗生素的种类决定；b. 根据NCBI非冗余蛋白质数据库的最高识别点击率，预测宿主功能选择的耐药基因；c. 肠道耐药基因在早产儿、仅早期抗生素治疗的早产儿和早期及随后抗生素治疗的早产儿之间存在差异；d.与近足月的婴儿相比，早产儿肠道宏基因组中编码的独特耐药基因较少；e. 早期和随后进行抗生素治疗的早产儿肠道微生物区系中的累积耐药组相对丰度显著高于仅接受早期抗生素治疗的早产儿和近足月儿; f. 随机的森林模型训练了早产儿的肠道耐药性，却不能很好地预测出近期婴儿的实际年龄; g. 50个最具信息性的抗性基因在足月儿和早产儿生命最初几个月的相对丰度变化;
4 耐多药Enterobacteriaceae在早产儿肠道中的持久性
研究者优化培养条件以分离机会性肠外病原体，已知这些病原体在婴儿肠道中高度富集，以及那些经常发生多重耐药的病原体。总共，研究者从这30个样品中培养了530个分离株，分别对来自早产和足月组的277个和253个分离株进行全基因组测序、组装和注释。通过这种直接选择最常分离的菌种依次是，E. coli (n=139)，K.pneumoniae(n=62)，E.faecalis (n=50)，Enterobactercloacae (n=42)，Enterococcusfaecium(n=22)，Citrobacterfreundii (n=15)和Klebsiellaoxytoca (n=14)。我们鉴定了从早产儿和早产儿采集的样品中几乎相同的E. coli, E. cloacae 以及K. variicola在婴儿体内的持久性。这些高度相似的持续分离株对来自婴儿，包括在住院期间和出院后收集的样本中的分离株(图4)。研究者从新生儿重症监护病房和出院后的早产儿肠道中分离出几乎完全相同的多药耐药Enterobacteriaceae，其平均核苷酸识别度超过99.997%(图4b,d,f)。这些数据支持与早产、早产住院和抗生素治疗相关的持久和可传播的病理性微生物群落。有趣的是，
图4 多重耐药Enterobacteriaceae lineages在婴儿肠道菌群中持续存在. 从婴儿粪便样本中分离的E. coli(a)、Klebsiellaspp (c)和E. cloacae (e)的最大似然核心-基因组系统发育；E. coli (b),Klebsiella spp(d) 和E. cloacae (f) 的平均核苷酸同一性(ANI)热图，表明持久分离株是同源的-即它们具有超过99.997%的核苷酸同源性，持久隔离对以红色突出显示; g. 从婴儿粪便标本中分离持久性Enterobacteriaceae细菌的时间线,竖线表示婴儿出院的日期，显示的前两个婴儿是早产儿，而第三个是足月儿.
5 抗生素治疗所引起的肠道菌群持久性宏基因组特征
为了进一步地了解早产儿、住院和抗生素治疗是否对肠道菌群含量和功能产生持续地影响，研究者试图找出相关宏基因组特征，以区分早产儿在新生儿重症监护室出院后的样本与年龄匹配的近期未使用抗生素的婴儿的样本。研究者使用有监督的学习方法，根据婴儿肠道中细菌类群和抗生素耐药相关基因的相对丰度，将样本分类为来自住院早产儿(包括仅限早期和早期及随后的抗生素治疗组)或居住在家中的足月婴儿。使用支持向量机算法，研究者识别了15个最具信息的特征，并构建了仅由这些变量组成的模型，该模型正确地分类了所有的早产儿和17个短期样本中的15个(96.4%的准确率；图5a)。在对模型性能最重要的15个变量中，6个是抗生素耐药相关基因，9个是细菌分类群
图5 对早产儿的肠道菌群的持久损害. a. 支持向量机混淆矩阵基于从新生儿重症监护室出院后菌群中存在的菌种和耐药基因对孕龄进行分类; b. 对分类最重要的15个预测因子, 仅使用这15个预测因子训练的稀疏模型具有很高的精确度 (96.4%的分类准确率)，是早产和相关住院和抗生素治疗的持久元基因组特征；
结论
在本研究中，研究者通过将宏基因组测序、选择性和差异粪便培养与分离测序、功能宏基因组学和机器学习相结合的方法，比较分析了早产儿早期使用抗生素治疗和住院治疗的粪便宏基因组特征。尽管肠道菌群的成熟度明显恢复，早期使用抗生素治疗的肠道菌群特征是具有丰富的肠道菌群耐药性和肠道持续存在的Enterobacteriaceae。不管早产或抗生素暴露，尽管研究者使用了广泛的功能分类法，所观察到的肠道菌群的功能变化并不是很显著。上述研究强调了整合基于测序和培养的方法来检查肠道菌群的必要性，以揭示扰动的未被充分认识的影响。这些互补方法提供的数据支持在婴儿肠道内菌群的动态群落结构中，早产儿住院治疗和抗生素治疗与早产相关的持久性的宏基因组特征。值得注意的是，研究者暂时未能将抗生素的影响与其他与早产儿相一致的不良早期事件(如延长住院和疾病)的影响隔离开来。虽然目前在新生儿中探索这些变量的干预性研究是不可行的，但未来的基于模式动物的研究可以在一定程度上提供对上述变量的相对贡献的重要参考。
评论
肠道微生物在宿主的一生中，特别是在婴儿期，对宿主的健康和疾病的发生发展有着十分重要的作用。婴儿肠道菌群(Infant gut microbiota, IGM)在其出生后的最初几个月里会加速组装，在此之前，婴儿会从母体和环境中接种微生物，但在大约三岁时就会稳定下来。在这段时间内用抗生素治疗可能会不成比例地破坏宿主-菌群建立起来的生态系统。事实上，最新的研究表明，早期肠道微生物的变化与后来生活中的慢性代谢和免疫紊乱相关，包括过敏、牛皮癣、肥胖、糖尿病和炎症性肠病等。然而，对于大多数这些疾病来说，抗生素介导的菌群结构的破坏和病理发生之间缺乏必要的因果联系。对此，相关研究发现，婴儿早期的抗生素治疗与儿童期的永久性免疫改变和炎症性肠病有关，这一结果强调了早期抗生素治疗对人体的长期破坏性潜力。
就目前而言，在全球范围内，超过11%的婴儿出现早产及其相关后遗症是导致儿童发病率和死亡率的主要原因。由于细菌感染是早产的常见并发症，美国新生儿重症监护病房(neonatal intensive care units, NICUs)中有将近79%的较低出生体重和87%的极低出生体重婴儿，在出生后3天内接受了抗生素治疗。即使是健康的婴儿，其胃肠道也存在多种抗生素耐药性，其形成受抗生素治疗、饮食和环境等诸多因素的影响。