摘要：分子编写可进行以下四方面工作：（1）新型育种标记的创制及验证；（2）跨物种分子编写；（3）基因组中碱基序列的删除；（4）物种内分子编写。该育种技术可以不通过有性杂交，只引入一个或几个目标基因或SNP，快速获得目标性状突出的遗传稳定新种质，然后结合常规育种方法育成新品种。该方法将实现真正的个体和群体水平的基因（或分子）杂交育种，获得分子杂种优势，能够高效的解决长久以来困扰育种工作的诸多难题，大大提高育种效率，尤其在畜禽育种中具有重要应用前景，将会是未来育种的发展方向。
本文将详细论述常规动物育种技术的现状和难点以及分子编写育种方法的基本概念、研究手段、研究内容、研究现状并展望其发展前景和对育种工作的影响，为动物育种、畜禽养殖以及相关政策制定提供参考。
一、动物育种的现状与难点
培育动物新品种的主要方式是杂交育种和选择育种。以猪的育种为例，所有的现代种猪几乎都是通过不同品种的猪杂交并长期选育而成的。《英国大百科全书》记载“现在欧洲的猪种，是当地猪种与中国猪杂交而成”。比如著名的约克夏猪（Yorkshire）和巴克夏猪（Berkshire）都是将广东猪种和英国当地猪种杂交，并经过长期选育而形成的。美国的切斯特白猪（Chester White）、波中猪（Poland China）则是在1817年引进华南猪杂交改良并长期选育而成。
杂交育种为动物养殖业的发展做出了巨大的贡献。中国从20世纪50年代开始，开展了广泛的“土洋”猪杂交育种。通过地方品种与引进品种的杂交，把引进品种的瘦肉率高、日增重快、饲料转化率好的特点与我国地方品种的繁殖力高、肉质好、适应性强的特点结合在后代中，再通过连续不断的选择，培育出大量优质、高效的生猪新品系和配套系。而且到目前为止，杂交技术也是一项在常规的商品猪生产中广泛使用的技术，用于生产各种经济性状均较为理想的杂种商品猪，如杜长大三元杂交猪等。
但是杂交育种存在明显的不足。一是不同品种猪杂交后，后代在引入优质基因的同时，也引入了大量劣性基因，为了选育出优良的杂交后代，必须配备大量的人力并长期进行观察和测定。这种选育过程要不断持续几十年之久。如今风靡世界的长白猪、大白猪等著名品种，都是经过将近百年的选育才培育成功。漫长的选育过程导致动物新品种培育的人力成本、时间成本和经济成本居高不下。
二是常规的选育方法无法对那些难以观察和测定的复杂性状进行选育。比如抗病性状在不发病时无法观察，而在持续攻毒的条件下进行测定和选育又会对养殖场造成巨大的感染风险。另外测定成本较高的饲料转化率性状、肉质性状以及低遗传力的繁殖力等性状，用常规育种方法进行选育不仅成本高、可操作性差，而且选育进展也比较缓慢。随着环保要求以及消费水平的不断提升，规模化养殖和优良肉质品种将是未来动物养殖业的普遍需求，这就要求动物新品种的培育要向高抗病能力、优良肉质等方向发展，而这两方面恰恰是常规选育方法无法发挥其长处的地方。
三是杂交育种本身的规律就决定了，即便经过漫长的选育，劣性基因也不一定能完全从杂交后代中排除。根据基因的连锁和交换定律，染色体上相距很近的两个基因常常是连锁在一起的，作为一个单元进行遗传。所以不管如何延长选育时间，那些与优质基因连锁的劣性基因依然会存在。
二、分子编写育种的内容及研究现状
分子编写的研究内容主要包括：新型育种标记的创制及验证、跨物种分子编写、基因组中碱基序列的删除以及物种内分子编写等四项（图1）。
1、新型育种标记的创制及验证
遗传标记在育种中发挥着重要作用，但是目前已发现的有效的遗传标记如主效基因、因果SNP位点等数量有限，非常不利于育种产业的发展。
另一方面，也可以综合已有的不同品种猪的基因组数据、SNP数据、全基因组关联分析结果等生物信息学数据和文献，筛选与猪抗病、生长速度、瘦肉率、产仔数、肉质等重要经济性状因果相关或紧密相关的各种遗传标记（如SNP位点、酶切位点、结构变异、拷贝数变异等）、表观遗传标记（如microRNA、lncRNA、DNA甲基化修饰等）。
以上两种方式获得的遗传标记，可以进一步通过体细胞克隆的方法进行精准验证。例如验证SNP位点与目的性状的相关性（图2），就可以先利用分子改编技术的高精准性从同一个细胞系构建出多个SNP差异细胞系，然后再利用体细胞克隆动物细胞核遗传一致性，构建SNP差异群体。这个群体理论上具有完全一致的遗传背景，只在目标SNP位点存在单碱基差异。进一步分析SNP差异群体的表型，就能验证SNP位点与目标性状的相关性，及其对目标性状的贡献度。这种方法避免了全基因组选育中依赖算法造成的统计学误差，能更准确地验证SNP位点对目标性状的贡献度，从而获得因果SNP位点。
构建的SNP差异群体除了可以精准验证SNP对目标性状的贡献外，还可深入研究SNP影响目标性状分子机制，以及挖掘与目标性状相关的其他遗传标记的好材料。比如在同一品种、同一来源的细胞中实现单核苷酸的“转换”或“颠换”培育的SNP差异群体，它们在遗传背景上基本完全一致，这时不仅可以直接验证SNP对目标性状的贡献度，还可以通过高通量测序、功能基因组学及表观遗传学深入分析其分子机制。
而在不同品种间的细胞中分别实现单核苷酸的“转换”或“颠换”培育的SNP差异群体，其SNP变异相同，但遗传背景不同，这时就可以深入挖掘、筛查与目标性状相关的其他遗传标记（图2）。
综上所述，利用分子编写技术不仅能规模化的精准创制遗传突变，便于发现新型遗传标记，更可以精准验证SNP位点对目标性状的贡献度，改变目前全基因组选育中完全依赖算法造成的统计学误差，从而获得一批具有高度育种价值的因果SNP位点，形成自主知识产权及核心技术。另外在进行SNP验证时，还可以进一步解析SNP位点影响目标性状的分子机制，挖掘和筛查与目标性状相关的其他遗传标记。
2、跨物种分子编写育种
跨物种分子编写育种，即通过ZFN、TALEN或者CRISPR/Cas系统以及显微注射技术、体细胞核移植技术将一个物种中的基因精确插入或替换到另外一个物种基因组的特定位置中，或者在一个物种的基因组特定位置上，模仿另一个物种基因组中特定位置的碱基序列信息。常见的是将外源基因插入或替换到某一物种基因组上的特定位点中，如友好基因座中。该方法不仅能打破物种间的生殖隔离，引入外物种的优良基因，而且能在大大降低非预期效应的同时，充分发挥外源基因的育种价值。现有的跨物种分子编写育种研究可以分为以下三类：外物种基因的精确插入，外物种基因的精确替换以及外物种突变序列的模仿。
1）外物种基因的精确插入
外物种基因的精确插入目前已有报道。其主要方法是将具有特殊功能的外源基因的完整表达框，精确的定点整合到受体动物基因组中的特定位置中。使其整合位置以及表达模式完全可控，避免传统转基因技术中的非预期效应的产生。目前常选择动物基因组中的“友好基因座（safe harbor）”进行定点整合。友好基因座是指动物基因组中转录活跃且不影响动物生长、发育和生殖的基因位点，这些位点非常适合外源基因的表达，对外源基因是友好的，因此称为友好基因座。在开发和利用友好基因座进行外物种基因的精确插入方面，我国的科研工作者走在了世界前列。中国科学院广州生物医药与健康研究院鉴定出猪的Rosa26友好基因座，并在该位点实现外源基因的定点插入和替换。
西北农林科技大学利用CRISPR/Cas9n切口酶系统将结核抗性基因NRAMP1定点整合到奶牛基因组的友好基因座F-A位点中，不仅建立了一套高效、低脱靶率的将外物种基因精确插入奶牛基因组的技术体系，而且有望利用此成果培育出抗牛结核病的新型奶牛品种，市场潜力巨大。
2）外物种基因的精确替换
在外物种基因的精确替换方面，美国密苏里大学通过CRISPR/Cas技术将猪CD163基因的第7外显子精确替换为人的同源序列。猪CD163蛋白是巨噬细胞表面的一种蛋白，在猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染过程中能介导PRRSV病毒进入巨噬细胞，而人的同源蛋白却不介导PRRSV的感染，从而使得PRRSV病毒无法感染人类。该研究精确替换了CD163基因的第7外显子，不仅能深入探索PRRSV病毒感染机制，更有望在保留猪CD163蛋白基本功能的前提下，删除CD163对PRRSV病毒的介导作用，从而培育出既能抵抗PRRSV病毒，又不会因CD163敲除而可能携带某些缺陷的新型抗病猪。
3）外物种突变序列的模仿
3、基因组中碱基序列的删除
分子编写育种的第二方面是：基因组中碱基序列的删除。除了打破生殖隔离，跨物种的引入基因或碱基突变外，分子编写育种还包括在同一物种内对基因组进行精细操作，精确删除基因组上的某些无用甚至有害的碱基序列。比如在进化中整合到基因组上的内源性逆转录病毒、导致应激综合征的基因、疾病易感基因以及某些病毒或细菌的受体基因等。将这些基因或序列精确的剔除掉，就能定向培育出更为优质，更符合人类、养殖、食用医药研发等多种不同需求的生物新品种。
1）内源性冗余序列的删除
猪的内源性逆转录病毒是在长期进化过程中整合到猪基因组中的，对猪本身已经没有毒性，但是在进行异种器官移植时却有可能对人体安全造成威胁。通过分子编写，美国哈佛大学的杨璐菡团队成功删除了猪基因组中几乎全部的逆转录病毒序列，并通过体细胞克隆技术获得了世界上首批适合进行异种器官移植的无内源性逆转录病毒的小型猪，该研究对培育异种器官移植用小型猪新品种具有重大意义。同样，通过分子编写技术，删除其他物种基因组中的内源性病毒序列，也能够培育出更安全，适用于医学研究和应用的生物新品种。
2）负作用基因和因子的删除
牛奶和羊奶中的β-乳球蛋白是人乳中不含有的蛋白，是奶制品中的过敏原之一。通过分子编写技术将牛或羊基因组中的β-乳球蛋白基因敲除，从而可降低牛羊乳中过敏原的含量，培育出不含β-乳球蛋白的牛羊新品种，缓解部分人群牛乳过敏症状。2011年，中国农业大学利用ZFN技术成功敲除牛基因组中的β-乳球蛋白基因，获得β-乳球蛋白敲除的奶牛，为培育低过敏原奶牛打下了良好的基础。
3）与疾病易感相关基因和因子的删除
抗病能力是动物育种中具有重要经济价值的一种表型。但是传统育种手段在选育抗病品种时缺乏合适的指示性状，而攻毒后再测定则成本高昂，并会对生产有不利影响。分子标记辅助育种存在分子标记较少，各个抗病分子标记间的关系复杂，抗病性状与部分生产性状存在拮抗等多种问题。因此抗病动物品种的培育工作一直进展缓慢。而分子编写育种则可以通过直接删除疾病易感基因或者病毒受体基因，快速培育具有抗病性状的动物新品种，将大大加快抗病动物新品种的培育速度。
动物传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathy,TSE）是一种可以感染人类和牛、羊等动物的致死性中枢神经系统疾病。这种疾病不仅对牛、羊等动物养殖业造成巨大损失，还直接威胁着人类健康。通过动物分子编写技术，敲除动物中引起TSE疾病的PRNP基因，就能获得抗TSE的动物。如敲除PRNP基因的抗疯牛病牛，和抗羊瘙痒病绵羊、山羊等动物新品种。这类抗TSE动物新品种的进一步推广和应用，将会大大提升畜牧业生产和人类健康的安全保障。
4、物种内分子编写
育种分子编写育种的第三方面是：物种内分子编写育种。常规的杂交育种手段无法精确的将“好基因”和“坏基因”分开，因此往往在导入优质基因的同时也导入了大量的劣性基因。尤其是那些互相连锁的基因，常规的杂交育种手段是无法分开的。物种内分子编写育种就能解决这一问题。分子编写育种可以在同一物种内对动物基因组进行精细操作，模仿同一物种中其他品种上的碱基突变或SNP位点，将多个品种的优质遗传突变信息，如基因突变以及启动子、增强子、内含子等多种非编码区域上的SNP位点、突变序列等模仿和替换到一个品种上，实现真正意义上的“分子杂交”。
比如在猪的育种中，分子编写育种可以精确的将地方猪的肉质优良、抗逆性强的基因替换到商用品种中，或者将商用品种生长速度快、饲料利用率高、瘦肉率高的基因替换到地方品种中。甚至可以精确的实现品种间、个体间碱基突变或SNP位点的模仿，直接获得分子杂种优势，替代有性杂交，实现真正的猪个体和群体水平的“分子杂交”育种。
通过对“瘦肉型”和“肥肉型”猪的QTL分析发现，“瘦肉型”猪（如大白猪、皮特蓝猪）与“肥肉型”猪（如野猪、梅山猪）相比，其类胰岛素生长因子2（Insulin-like growth factor2,IGF2）的第三内含子的第3072位碱基存在G到A的SNP位点，该SNP位点对猪的生长速度、瘦肉率、背膘厚、背最长肌面积以及心脏重量等性状有着非常显著的影响，可以使猪的肌肉量增加15%—30%，背膘厚减少10%20%。该SNP位点应该是在“瘦肉型”猪的培育过程中自然突变后经过漫长的人工选育固定下来的。如果通过物种内分子编写育种，将该SNP位点直接精确的引入到我国地方品种猪中，就能快速的提高我国地方品种猪的产肉性能，对我国地方品种猪的改良意义重大。
在欧洲和美国的奶牛养殖业中，常常出于生产安全以及对工作人员的保护将奶牛的角去掉。但是去角的过程不仅增加了养殖成本，对奶牛来说也非常痛苦，与动物福利和动物保护的宗旨不符。目前已选育出某些肉用品种的牛有无角性状，如安格斯肉牛（Angus cattle），其无角性状主要由1号染色体上的POLLED基因决定。如果通过杂交育种的方法培育无角奶牛，不仅需要非常长的选育时间，而且杂交后代的产奶性能一定会受到肉牛某些基因的影响，产奶性能会降低。TAN等利用TALEN技术成功将肉牛的无角基因POLLED定点整合到有角奶牛的基因组中，由此可培育出既保持高生产性能，又无角的奶牛新品种，免除了奶牛切角的痛苦。
禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）极大的威胁着禽类养殖业和人类健康。培育能抵抗禽流感的禽类动物，一直以来都是养殖和育种从业人员的梦想。2011年，英国罗斯林研究所通过转入干扰RNA来抑制禽流感病毒的增殖，获得了较好的抗病效果。未来则可以借助分子编写技术，将其他品种中对禽流感病毒有抵抗力的基因直接模仿和替换到生产性能较高的品种上，进而快速获得对禽流感病毒具有一定抵抗力的新品种动物。
2015年，一种能快速生长的转基因三文鱼——水优三文鱼（aquAdvantage salmon）通过美国食品药品监督管理局（food and drug administration,FDA）的审批，获准上市销售。2017年，首批水优三文鱼已经正式上市销售。这种三文鱼本身为大西洋三文鱼（atlantic salmon），转入了另外一种三文鱼——大鳞三文鱼（chinook salmon）的一个生长激素调节基因，以及一个来自美洲大绵鳚（ocean pout）的启动子，用来调节生长激素的合成，从而使得它们能够全年生长，因此生长速度比普通三文鱼快一倍，节省约75%的饲料。该品种采用的是传统的转基因技术，因此经历了较为漫长的审批过程。如果采用品种内分子编写技术，将其他品种三文鱼的优质基因或启动子序列替换到大西洋三文鱼中，相信将更加容易获得消费者的认可。
分子编写育种的目的是改良品种并将优良的遗传基因传递至商品代。因此除了上述的对动物基因组的分子操作外，分子编写育种还需要紧密结合目前广泛使用的常规育种方法，持续对分子编写群体进行选配、测定、评估，根据评估结果选择优良个体建立核心群（图1）。然后依次建立纯种扩繁群商品生产群，将优良基因传递给商品群。在核心群的建立和维持过程中，测定和评估是关键环节。不仅要进行性能测定、体型评估等常规测定，还需要进行基因测定，获取其遗传标记信息，以便通过全基因组选择和测序分型进行更准确的选种。也就是说，通过分子编写技术获得的、遗传性状得到“质变”的群体，还需要结合全基因组选择、标记辅助选择等多种育种方法进一步不断选育、不断迭代、不断积累“量变”，才能保持遗传性状的优良。
四、分子编写育种的前景
综上所述，分子编写育种一方面可以在物种间实现优质基因或序列甚至是SNP的流动、替换，打破物种间的生殖隔离，充分发挥优质基因的育种价值。另一方面可以在物种内真正实现个体和群体水平的分子杂交育种，快速获得具有分子杂种优势的生物新品种。跨物种分子编写育种与转基因技术相比，精确性大大提高，因此可以大大降低外源基因随机整合以及表达量不可控导致的非预期效应，更加精准，更加高效，更加安全。而物种内的动物分子编写育种，在真正实现分子杂交的同时，完全不含其他物种的DNA序列，在本质上与传统育种方法获得的个体完全没有差异，可以说等同于传统育种方法获得的遗传变异个体。
除不断提高CRISPR/Cas技术的精确修复能力外，CRISPR/Cas技术的特异性也已经得到极大的改善。主要优化方法可分为对Cas9蛋白的改造和针对sgRNA的改进。在Cas9蛋白的改造方面，其主要策略包括将Cas9蛋白的核酸内切酶失活，只保留DNA识别能力，同时与其他核酸内切酶融合形成复合体，如FokⅠ-dCas9复合体，进而提高对靶序列切割的特异性。其次是对Cas9蛋白进行点突变，筛选与DNA结合特异性更高的突变体，如增强型eSpCas9、高保真型Cas9-HF1等。针对sgRNA的改造是改变sgRNA的长度，研究表明在sgRNA的5’端的减少2—3个碱基或在识别序列前加2个鸟嘌呤，能够在不影响切割活性的情况下，降低脱靶率大约5000倍。
单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，陆军军医大学基础医学院实验动物教研室，深圳市金新农科技股份有限公司