Nature Genetics：艱難梭菌形態形成過程中宿主傳播週期的適應性

原創 羅睺 微生態 2019-09-15

導讀

細菌形態形成是一個基本的進化過程，其特徵是不同的基因型和表型特性。然而，影響基因適應的選擇壓力以及它們與支撐新細菌物種形成的生物學變化之間的關係尚不清楚。本研究表明，與孢子形成、醫療相關的腸道病原體艱難梭菌正在積極進行物種形成。通過對906株菌株的大規模基因組分析，作者證明了正在進行的物種形成過程與參與孢子形成和單糖代謝的新形成物種核心基因的陽性選擇有關。功能驗證表明，新的艱難梭菌產生的孢子具有更強的抵抗力，當葡萄糖或果糖可用於新陳代謝時，孢子的形成和宿主的定植能力均會增加。本研究中，作者報告了一種新出現的艱難梭菌物種的形成，新形態可用於代謝簡單的膳食糖併產生高抗性水平的孢子，適於醫療介導的傳播。

論文ID

原名：Adaptation of host transmission cycle during Clostridium difficile speciation

期刊：Nature Genetics

IF：25.455

發表時間：2019年8月

通信作者：Nitin Kumar, Trevor D. Lawley

通信作者單位：英國辛克斯頓維康信託桑格研究所微生物群-宿主互作實驗室（Host-Microbiota Interactions Laboratory, Wellcome Sanger Institute, Hinxton, UK）

研究內容

從其原種形成一個新的細菌物種的特點是遺傳多樣性和生物適應。幾十年來，一種依賴於細菌基因型和表型特性的多相檢測被用來定義和區分“物種”。細菌分類學最近使用了大規模基因組分析來整合細菌自然歷史的各個方面，如生態學、基因水平轉移、重組以及系統發育。雖然可以通過基於全基因組的方法對細菌物種進行更準確的定義，但選擇壓力如何影響生物途徑的適應和表型變化，進而導致細菌物種形成。人們對此仍然缺乏全面、詳細的理解。在本研究中，作者描述了在現代醫療環境中，一種可在人類種群傳播的高度分化的

基於1322個連鎖的單拷貝核心基因的最大似然系統發育(圖1a)說明了該集合中存在四個主要的系統發育群。1322個單拷貝核心基因串聯排列的群體結構(Baps)貝葉斯分析證實了四個不同的系統發育類群(PG1–PG4)的存在。每個分支菌株都來自不同的地理位置、宿主和環境來源，這表明了共生形態的信號。每個系統發育組也有不同的臨床相關核型（RTS）：PG1：RT001, RT002, RT014；PG2：RT027和RT244; PG3：RT023和RT017；PG4：RT078, RT045和RT033。

圖1：艱難梭菌的系統發育和種群結構。

系統發育分析表明，近緣種(C.bartlettii、C.hiranonis、C.ghonii和C.sordellii)為外群(圖1a)，艱難梭菌的三個系統發育類群（PG1、 PG2和PG3）均來自多樣性最高的系統發育群(PG4)。這一點也得到了單核苷酸多態性（SNP）頻率的支持，即PG4菌株和其他PG菌株之間成對比較的單核苷酸多態性（SNP）差異頻率和PG1、PG2和PG3菌株之間成對比較的SNP差異水平（補充圖2）。與生長在營養瓊脂平板上的PG1、PG2和PG3的細菌相比，PG4的細菌表現出不同的菌落形態（補充圖3），這表明艱難梭菌菌落表型和區分PG1、PG2和PG3與PG4的基因型之間存在聯繫。

補充圖2 艱難梭菌不同系統發育群的成對SNPs差異。

補充圖3 艱難梭菌菌落形態

作者之前使用30個艱難梭菌基因組進行的研究發現存在可能出現在1-8500萬年前古老的遺傳多樣性物種，使用更大的數據集對這一估計進行驗證，這表明該物種大約在1350萬年（1270-1430萬）前出現。使用相同的方式對大量擴展的集合進行分析，作者估計PG4的最新共同祖先大約出現在385000年前。相比之下，PG1、PG2和PG3的最新共同祖先大約出現在76000年前。Bayesian分析顯示，大約在公元1595年左右，在18世紀現代醫療系統出現之前不久，PG1、PG2和PG3出現種群爆發。綜上所述，這些觀察結果表明，

為了研究基因組相關性，作者接下來進行了配對ANI分析（圖1b）。該分析顯示，PG1、PG2和PG3之間的核苷酸同源性較高（ANI > 95%），這表明這些群體中的細菌屬於同一物種；而PG4與其它PG之間的ANI值要麼小於物種閾值(ANI>95%)，要麼處於物種閾值邊緣(94.04%~96.25%)(圖1b)。為了檢測重組事件，對906株菌株的全基因組序列進行了FastGEAR分析。儘管分析發現艱難梭菌A內重組增加，但觀察到艱難梭菌A與B之間的重組事件數量有限。這一分析表明核心基因組中存在重組障礙，進一步區分艱難梭菌的兩個分支，並可能促進同域物種形成。此外，基因組功能分析也顯示了A族和B族之間的清晰分離。作者還觀察到clade A中的假基因數量高於clade B中的假基因數量。綜上所述，這些結果表明艱難梭菌A和B族的基因組選擇壓力不同。

除了減少重組事件的發生率外，由陽性選擇壓力驅動的群體中的優勢遺傳變異體（稱為正選擇）也是物種形成的標誌。作者測定了Ka/Ks比值（非同義位點非同義亞基數量（Ka）與同義位點同義亞基數量（Ks）之比），並鑑定了A族172個核心基因和B族93個核心基因，這些基因均為陽性選擇（Ka/Ks>1）。在clade A中，功能註釋和富集分析確定了與碳水化合物和氨基酸代謝、糖磷酸轉移酶系統（pts）、孢子外殼結構和孢子組裝有關的陽性基因（圖2b）。相比之下，硫傳遞系統是從clade B陽性選擇基因中唯一豐富的功能類別。特別是，艱難梭菌clade A陽性選擇基因中有26%（總共45）產生了直接參與孢子生長的蛋白質，這些蛋白質存在於成熟的孢子蛋白質組中或受Spo0A調控，或產孢特異性的sigma因子調節（圖2c）。相比之下，艱難梭菌clade B分支中沒有直接參與孢子產生的陽性選擇基因；然而，成熟孢子蛋白質組中存在22.5%（共21個基因）或受Spo0A調控，或其特定於孢子的sigma因子。兩個譜系中與孢子形成相關的陽性選擇基因之間缺乏重疊，表明孢子介導的傳遞功能存在分歧。此外，這些結果表明，艱難梭菌clade A進化出了對宿主間傳播至關重要的功能。

圖2艱難梭菌clade A菌株產孢和代謝基因的適應性。基於1322個核心基因的艱難梭菌clade A和B菌株的陽性選擇分析。

a，艱難梭菌clade A（n=172個基因）和B（n=93個基因中陽性選擇基因的ka/ks比值分佈。

b，顯示了艱難梭菌clade A（n=172個基因）和B（n=93個基因）陽性選擇基因的富集。y軸表示每個富集功能中陽性選擇基因的數量。均具有統計學意義（糖磷酸轉移酶系統，Q=0.00167；果糖和甘露糖代謝，Q=0.001173；產孢、分化和萌發，Q=0.0165；半胱氨酸和蛋氨酸代謝，Q=0.00279；硫轉運系統，Q=0.00791）。

c，艱難梭菌clade A中陽性選擇的產孢相關基因顯示為藍色。在陽性選擇的172個基因中，有26%（共45個）參與孢子產生（孢子形成階段I、III、IV和V），其蛋白質存在於成熟孢子蛋白質組中，或受Sp0A調控或其孢子形成特異性Sigma因子。

作者在clade A中發現了20個陽性選擇基因，其產物是成熟孢子的組成部分，可以促進環境生存。例如，SodA（超氧化物歧化酶A），一種與孢子外殼組裝相關的基因，在所有A族基因組中有三個突變點，但在B族基因組中不存在。來自不同艱難梭菌科的孢子對來自氣體等離子體的微生物自由基的抗性有很大差異。為了研究新譜系孢子的表型抗性特性是否已經進化，作者將兩個譜系的孢子暴露於過氧化氫（一種常用的醫療環境消毒劑）中。雖然在30%的過氧化氫條件下存活率沒有差異，但來自clade A的孢子對3%（p=0.0317）和10%的過氧化氫（p=0.0317）的抗性比來自clade B的孢子更強（p=0.1667）（圖3a）。艱難梭菌產孢主調控因子Spo0A僅在艱難梭菌clade A中處於陽性選擇狀態。Spo0A還控制其他宿主定植因子，如鞭毛和碳水化合物代謝，可能有助於介導細胞過程，將能量引導到孢子產生和宿主定植以促進宿主之間的傳播。有趣的是，clade A基因組含有陽性選擇的基因，這些基因與果糖代謝（fruABC和fruK）、糖酵解（pgk和pyk）、山梨醇（CD630_24170）和核糖醇代謝（rep1）以及丙酮酸轉化為乳酸（ldh）有關。

為了進一步探討clade A組中孢子形成與碳水化合物代謝之間的關係，作者利用KEGG通路和人工誘導技術分析了陽性選擇的基因。對艱難梭菌clade A組172個陽性核心基因的關鍵富集途徑進行篩選，鑑定出一條完整的果糖特異性PTS途徑，並鑑定出4個基因（30%，4/13）參與糖代謝過程中的厭氧糖酵解。與富集的PTS途徑相關的其他基因包括用於甘露醇、纖維二糖、葡萄糖醇（也稱山梨醇）、半乳糖醇、甘露糖和抗壞血酸的細胞攝取和代謝的基因。此外，對碳水化合物活性酶（CAZymes）的比較分析發現艱難梭菌clade A和B分支之間的CAZymes明顯分離。綜上所述，這些觀察結果表明，艱難梭菌兩個分支之間的功能存在差異，並且與廣泛的單糖代謝有關。

單糖葡萄糖和果糖越來越多地用於西方飲食，其特點是食用高水平的加工食品、糖和脂肪。巧合地是，海藻糖作為一種用作食品添加劑的葡萄糖雙糖，已經影響了一些人類毒性艱難梭狀芽胞桿菌的出現。基於本研究的基因組分析，作者推斷飲食中的葡萄糖或果糖可能通過艱難梭菌clade A或B分支的孢子對寄主的定殖產生不同的影響。因此，作者用葡萄糖、果糖或核糖補充小鼠的飲用水，並用A菌株或B菌株進行測試。核糖代謝基因未被陽性選擇，故將該糖作為對照。當暴露於膳食葡萄糖（p=0.048）或果糖（p=0.0045）中時，受到clade A孢子感染的小鼠比clade B（圖3b）表現出更高的細菌負荷。沒有添加糖或添加了核糖（p=0.2709）的艱難梭菌clade A和B之間的細菌負荷沒有差異（圖3b）。

環境孢子密度有助於艱難梭菌在醫療環境中的感染性和傳播。為了確定單糖利用率對孢子產生率的影響，作者評估了兩個譜系單獨或補充葡萄糖、果糖或核糖在基礎限定培養基（BDM）中形成孢子的能力。雖然在添加了核糖（對照組）的艱難梭菌clade A和clade B中沒有觀察到差異（p=0.3095），但在添加了葡萄糖（p=0.0317）或果糖（p=0.0317）的情況下，艱難梭菌clade A菌株的孢子產量增加（圖3c）。這些結果提供了實驗驗證，並與基因組的研究數據共同表明增加宿主定殖和通過食用單糖進行孢子介導的傳播是艱難梭菌clade A類的一個特徵，而不是clade B類。

最近出現的艱難梭菌作為一種重要的衛生保健病原菌，其主要原因是通過水平基因轉移在運動元件上獲得了抗生素抗性和碳水化合物代謝功能。這些最近的基因組適應發生在已建立的、獨特的進化譜系，每個核心基因組表達獨特的、預先存在的傳播特性。本文揭示了一個新物種的不斷形成，其生物學和表型特性與現代醫療系統中人類傳播的傳播週期一致（圖3d）。

圖3細菌形態的形成與宿主適應和傳播能力的增強有關。

a. 艱難梭菌clade A的孢子比clade B的孢子更耐受廣泛使用的過氧化氫消毒劑。

b. 與B類菌株相比，在單糖存在條件下，A類菌株的腸道定植增加。

c. 在單糖存在的情況下，Clade A菌株比B菌株產生更多的孢子。

d. 艱難梭菌A關鍵方面的表型適應性形成一個傳播週期，增強了在人群中的傳播。

本研究還報告了艱難梭菌clade A（027譜系和017譜系）在世界不同地區的醫療保健系統中流行的不同傳播動力學和宿主流行病學，以及可能進入人類種群的078譜系。此外，在醫療保健系統中出現的艱難梭菌的廣泛流行病學篩選也強調了艱難梭菌A族菌株的高丰度；它們代表了68.5%（美國）、74%（歐洲）和100%（中國大陸）的感染菌株。因此，作者報告了艱難梭菌屬clade A物種形成、適應的生物學途徑和流行病學模式之間的聯繫。總之，本研究闡明瞭細菌物種形成是如何通過現代人類飲食、獲得抗生素耐藥性或醫療制度加速的過程而產生和傳播主要譜系的。

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關鍵字: 宿主 孢子 哺乳動物