前言
2020 年 1 月，浙江大學毛傳澡教授課題組在 Plant Cell 雜誌發表題為“PROTEIN PHOSPOHATASE 95 Regulates Phosphate Homeostasis by Affecting Phosphate Transporter Trafficking in Rice”的研究論文，該研究揭示了水稻磷素平衡的重要調控通路：蛋白磷酸酶 PP95 通過調控水稻磷轉運體的磷酸化水平，從而影響其從內質網向質膜的轉運及植物體內磷穩態。
毛傳澡教授課題組博士研究生楊支力與四川大學生命科學學院楊健副研究員為該論文的共同第一作者，毛傳澡教授與楊健為該文的通訊作者。
基本信息
文章標題：PROTEIN PHOSPHATASE 95 Regulates Phosphate Homeostasis by Affecting Phosphate Transporter Trafficking in Rice
發表期刊：Plant Cell
影響因子：8.631
文章中酵母文庫實驗，由歐易生物完成。
研究背景
磷是植物生長髮育必需的大量營養元素之一。植物磷的吸收很大程度上依賴於質膜定位的磷酸鹽轉運體 PT 蛋白。PT 蛋白在植物不同組織部位表達存在很大差別。同時在轉錄後水平上，PT 蛋白也會發生一系列的修飾事件，比如水稻蛋白激酶 CK2 能夠磷酸化 PT 蛋白，並抑制 PT 蛋白從內質網輸出轉運到質膜。蛋白磷酸化是一個可逆的過程，然而是否有蛋白磷酸酶調控 PT 去磷酸化及植物磷平衡並不清楚，也正是本研究關注的重點。
研究內容
本研究通過酵母雙雜交實驗發現並鑑定了一個 PP2C 家族的蛋白磷酸酶 OsPP95，它能在體內和體外與 OsPT8 相互作用並去磷酸化 OsPT8。OsPP95 基因的過表達會降低 OsPT8 的磷酸化水平，從而促進 OsPT8 從內質網到質膜的轉運，最終導致磷在水稻中的積累。在磷充足條件下，OsPP95 突變並不會改變整株植物的無機磷含量；但與野生型相比，ospp95 突變體新葉中的無機磷濃度降低，而老葉中磷濃度增加。通過進一步研究發現 OsPHO2 可以與 OsPP95 相互作用並降解 OsPP95。綜上，該研究發現並鑑定了一個受 OsPHO2 調控的蛋白磷酸酶 OsPP95，它和蛋白激酶 CK2 拮抗調控 PT 的磷酸化狀態，影響 PT 從內質網向質膜的轉運，進而調控植株磷的平衡。該研究揭示了一種可逆的 PT 蛋白磷酸化機制，這對植物適應磷濃度不斷變化的外界生長環境是必不可少的。
研究結果
1. OsPP95 與 PT 蛋白直接互作
通過 GFP 標記 PT 蛋白進行細胞亞定位分析，結果顯示，PT 蛋白從內質網（ER）到質膜（PM）的運輸依賴於蛋白磷酸酶 PP2C 家族介導的 PT 蛋白去磷酸化。以 OsPT8 為誘餌進行了膜系統酵母文庫的篩選，最終鑑定到一個屬於 PP2C 家族的互作蛋白 OsPP95（下圖）。進一步的 Co-IP 和 BiFC 實驗證實，OsPP95 的 N 端和 OsPT8 的 C 端直接結合。細胞亞定位也顯示，OsPP95 廣泛表達於水稻各個組織、以及細胞內的各個部位，而 OsPT8 與 OsPP95 的互作主要發生於內質網部位。
2. OsPP95 調控磷平衡
為了研究 OsPP95 在磷平衡中的作用，構建了 OsPP95 過表達株系和敲除株系（PP95-OV、pp95 ）。與野生型相比，在富磷的情況下 PP95-OV 根和葉更小，但在乏磷的情況下二者沒有明顯差別（下左圖）。在乏磷的情況下，pp95 根中磷濃度顯著降低，老葉中磷濃度與野生型相當，但新葉中磷濃度降低；富磷情況下，兩者總體磷濃度沒有明顯差別（下右圖）。
3. OsPP95 與 CK2 拮抗以維持磷平衡
CK2 蛋白也可以結合在和 OsPT 的 C 端。對 CK2 進行 RNAi 和過表達（α3-Ri、α3-OV ），並分別與過表達 PP95 的水稻進行雜交。結果顯示，α3-Ri 根和葉磷濃度比野生型高（下圖 C）。α3-OV / PP95-OV 比單獨的 PP95-OV 或α3-OV 表現出更好的根葉生長。相比於正常對照，α3-OV 磷含量下降，而 PP95-OV 磷含量上升（下圖 F）。在乏磷的情況下，α3-Ri 新葉中磷濃度上升、老葉中磷濃度下降。以上結果表明 OsPP95 與 CK2 作用相反，二者之間拮抗調節磷的體內平衡。
4. OsPP95 直接介導 PT 蛋白去磷酸化
體外磷酸酶測定實驗證實 OsPP95 具有 Mn2+ 依賴性的蛋白磷酸酶活性。利用磷酸化 OsPT8 （p-PT8）的抗體進行Pull-down 實驗，結果顯示α3-Ri 內質網中p-PT8 上升，而 PP95-OV 中 p-PT8 降低，並且 p-PT8 在 α3-OV / PP95-OV 比 α3-OV 中要低（下圖 B）。體外實驗證實，OsPP95 可以導致 OsPT8 第 517 位絲氨酸去磷酸化（下圖 C）。
5. OsPP95 介導 PT 蛋白從內質網運出
與野生型相比，PP95-OV 的 PM 中 OsPT8 含量升高、ER 中含量下降，α3-OV 與之相反。在富磷情況下，pp95 ER 中 OsPT8 含量升高（下圖 A）。通過細胞亞定位實驗（下圖 C）進一步研究說明，OsPP95 可以與 CK2 拮抗作用調節 PT 蛋白從 ER 向 PM 的運輸。
6. OsPHO2 介導 OsPP95 降解
為了研究是否與已知的磷平衡蛋白具有相互作用，以 OsPP95 為誘餌進行了酵母文庫一對一驗證，結果顯示 OsPHO2 可以與 OsPP95 直接結合。富磷情況下，在 PP95 / pho2 中 PP95 蛋白濃度顯著高於 PP95，泛素化 PP95 濃度則顯著下降。這一結果表明，OsPHO2 參與泛素介導的 OsPP95 降解。
研究結論
本研究發現了一個與 PT 蛋白互作的蛋白磷酸酶 OsPP95，它可以與 OsCK2 拮抗性起作用以調節 PT 蛋白磷酸化水平以及 PT 蛋白從內質網向質膜的運輸，最終達到維持水稻體內磷平衡的作用。在富磷條件下，OsPHO2 促進 OsPP95 降解，內質網中 PT 蛋白被 OsCK2 介導發生磷酸化，使得 PT 蛋白無法與 OsPHF1 結合，也就無法運輸至質膜，以此減少磷吸收。在乏磷條件下，OsCK2β3 發生降解，而 OsPP95 表達穩定，因此 PT 蛋白在 OsPP95 介導下發生去磷酸化，進而與 OsPHF1 結合從內質網運輸至質膜，以此提高磷吸收。
參考文獻
Yang Z, Yang J, Wang Y et al. PROTEIN PHOSPOHATASE 95 Regulates Phosphate Homeostasis by Affecting Phosphate Transporter Trafficking in Rice. Plant Cell 2020; doi: 10.1105/tpc.19.00685.
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鄭小辮兒 撰文
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