外泌体在神经炎症相关疾病中的研究进展
目前中枢神经系统炎性疾病（包括神经退行性疾病、自身免疫性疾病等）的发病机制尚未完全明确，但越来越多的研究开始关注外泌体在其中所产生的作用。在复杂的细胞间通信系统中，外泌体是最小的起源于核内体的膜性纳米微囊泡。在正常或病理情况下，外泌体由各类细胞分泌释放，通过传递各种信号分子参与调节多种信号通路，发挥细胞间信息交流作用，进而影响受体细胞的活性。
外泌体不仅运载细胞蛋白和脂质，还可以包含宿主细胞的mRNA和miRNA。外泌体的表膜存在特异性分子标记，因此可以追溯其起源细胞，进而成为某些疾病潜在的诊断分子标志物。此外，由于拥有双分子脂膜结构，外泌体能够携带相关分子迅速通过血脑屏障。因此，在神经炎症相关疾病中，外泌体也可以成为其诊断以及治疗的靶点。对神经系统中外泌体的特征、分子机制及其与神经炎性相关疾病关系的进一步研究，有助于深化对神经系统外泌体的认识，为疾病预防和治疗提供新线索。现围绕外泌体在神经炎症相关过程中的研究进展进行综述。
1.外泌体概述
外泌体是一种直径为30～100nm的球形膜性囊泡，可以由不同类型细胞分泌，调节一系列细胞功能。与其他细胞微小囊泡类似，外泌体也可以转运生物分子到不同类型的细胞，而不同细胞来源的外泌体之间的主要区别在于直径大小以及细胞来源。与从细胞膜脱落相比，外泌体的形成稍显复杂，它是由细胞中的核内体膜通过出芽方式进入多囊泡复合体，多囊泡复合体与细胞膜融合后排至细胞外的小囊泡。
由于起源细胞的不同，外泌体可以携带细胞特异性的蛋白，脂质或编码以及非编码RNA。如Feng等研究显示，在大鼠心肌缺血预处理后，miR-22在骨髓间充质干细胞来源的外泌体的表达上调；而Pinto等发现在转染hSOD1-G93A后，神经干细胞来源的外泌体内与抗炎相关的miR-124会显著上调，改善小胶质细胞的激活。在外泌体表面存在一些特异性的蛋白，如四跨膜蛋白超家族（tetraspanin family）CD9、CD63、CD81和CD82。它们可以作为外泌体的标志物。此外，参与外泌体形成的一些重要蛋白，如多囊泡核内体蛋白Alix，肿瘤特异性蛋白101，带电多囊泡体蛋白4C以及核内体或核内体成熟相关蛋白脂筏标记蛋白和膜连蛋白（Annexin）都是外泌体的生物标志物。
外泌体起源细胞的类型很大程度地影响外泌体所运载的蛋白或相关RNA。一项神经胶质瘤基因组学研究发现，来源于神经胶质瘤细胞的外泌体运载携带着包括四跨膜蛋白超家族，纤维连接蛋白，热激蛋白，细胞骨架相关蛋白，prominin-1（CD133），basigin（CD147），B7-H3（CD276）等一系列参与防御反应、细胞分化、细胞增殖和调节其他重要生物过程的分子。这表明，神经胶质瘤细胞来源的外泌体可能在调节肿瘤微环境中起重要作用，是一种潜在的肿瘤生物标志物。除携带相关蛋白，外泌体也高度富集miRNA。在一项关于外泌体RNA的生物学筛选中发现，外泌体携带的RNA大部分为4～40个核苷酸长度，与miRNA的长度类似。
大量研究也显示，外泌体携带的miRNA对于受体细胞是有功能的，能够有效抑制受体细胞靶基因的表达。如被EB病毒感染的B细胞可以分泌含有编码病毒miRNA的BHFR1和BART，从而抑制邻近非感染树突状细胞中具有免疫调节功能的CXC趋化因子配体11基因。外泌体的摄取主要依靠外泌体膜上相关蛋白和脂质（如四跨膜蛋白超家族tetraspanin和磷酯酰丝氨酸）。其通过与存在于靶细胞脂膜上的互补分子相互作用而参与受体介导的内吞作用，并引起内化。但参与外泌体摄取内吞途径的细胞有很大的区别。如外泌体大部分的内化是由肝库普弗细胞、树突状细胞和脑内的小胶质细胞这类吞噬细胞通过吞噬作用完成的。而非吞噬细胞也可以依靠网格蛋白或独立的内吞途径来内化外泌体。Escrevente等发现卵巢癌肿瘤细胞可以通过一系列内吞途径和相关蛋白来内化外泌体。
2.中枢神经系统与外泌体
中枢神经系统中绝大部分细胞，如神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞都分泌外泌体。这些细胞在正常条件或病理状态下分泌的胞外囊泡可以从人体脑组织中和脑脊液中分离得到。在中枢神经系统中，神经细胞分泌的外泌体同样扮演着清除细胞内残片，传递神经细胞间信号的角色。因此，对于中枢神经系统的发育以及突触活性调节和神经损伤再生等方面外泌体也发挥着重要作用。成熟的神经元通过影响源于少突胶质细胞的抑制性外泌体的释放来调节少突胶质细胞的分化。
此外，为应答谷氨酸激活，少突胶质细胞可以分泌外泌体影响神经细胞的代谢，并通过少突胶质细胞的功能转移来实现神经保护作用。突触是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位。而不同神经细胞分泌的外泌体也通过传递重要蛋白参与突触兴奋这一过程。如胶质细胞在应激条件下分泌的外泌体包含一种叫突触素的蛋白，它是与神经发育有关的突触小泡相关蛋白。而源于小胶质细胞外泌体也可以提高受体神经元内神经酰胺和鞘氨醇的代谢，从而引起神经递质的增多。在某些不良环境下，这些神经细胞分泌的外泌体可以维持神经元存活，促进神经突起生长。外泌体同样也能参与神经保护的调节。一般而言，星形胶质细胞可以为神经元提高营养支持。在组织损伤情况下，为了提高邻近神经元存活，星形胶质细胞针对氧化应激会分泌更多富含热激蛋白70的外泌体。而在外周神经系统，神经损伤引起RhoA蛋白活性增加，这种蛋白会抑制轴突的再生，施万细胞产生的外泌体在一定程度上可以抑制RhoA活性，从而起到神经保护作用。
3.中枢神经系统疾病与外泌体
正常大脑功能运转离不开外泌体，而在许多神经炎症的病理过程中也涉及外泌体。越来越多的证据显示，在一些神经炎症反应的初期，由邻近细胞分泌的外泌体就会携带一些错误折叠蛋白或致病性蛋白，启动或者扩散炎症反应。除运转蛋白，外泌体还可以特异性地转运携带miRNA进入神经细胞，造成受体细胞基因表达失调。相关的研究总结如下。
3.1阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）与外泌体
AD是一种常见的与年龄相关的神经退行性病变。它主要的病理特征是脑中胞外β淀粉样蛋白（amyloid β，Aβ）聚集形成的淀粉样斑块和胞内高度磷酸化tau蛋白聚集成的神经纤维缠结。神经细胞内的Aβ被外泌体运载传播到邻近细胞或远处细胞，进而造成Aβ在胞外大量聚集形成淀粉样斑块。同样，tau蛋白的传播也离不开外泌体。研究显示，在早期AD患者的脑脊液中就能检测到高水平表达的外泌体相关tau蛋白。小胶质细胞可以吞噬并内化含有tau蛋白的神经元，并通过外泌体分泌tau蛋白向其他细胞转播或脑内各区域扩散。
现有的与外泌体相关的防治AD的诊断治疗靶点有多种。Goetzl等选取了12例AD患者和16例额颞叶痴呆患者同28名正常人进行横断面对比，结果发现，与正常人相比，AD和额颞叶痴呆患者源于神经细胞外泌体的突触小泡蛋白、突触足蛋白、突触结合蛋白相关基因2和神经颗粒蛋白会明显降低；而生长相关蛋白43与突触素1只在AD患者中降低。这一发现显示神经细胞外泌体突触蛋白在老年性痴呆中可能是有用的前临床指标和进展指标。而Gui等筛选AD患者和帕金森病（Parkinson's disease，PD）患者脑脊液中差异性表达的外泌体miRNA，并通过生物信息学技术找到了一些未来可能成为AD或PD防治新靶点的外泌体miRNA及其靶基因。
3.2PD与外泌体
PD是仅次于AD的第二大神经退行性疾病。它的主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体多巴胺显著减少而致病，临床上主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍。目前，一种突出前神经蛋白———核突触蛋白（α-synuclein，α-Syn）在细胞内增多被认为与PD病理改变相关。与AD相似，外泌体也被证明可以携带α-Syn到胞外环境并将有毒的低聚物转播给邻近神经细胞。有关研究显示，摄取运载有α-Syn的外泌体可诱导健康神经元死亡；除了神经元，星形胶质细胞也可以将病理神经元释放的α-Syn内化，这一现象与星形胶质细胞过度摄取α-Syn形成包涵体有关，也会进一步加重PD患者的脑内炎症反应。
除了α-Syn，富亮氨酸受体激酶2（leucine-rich receptor kinase 2，LRRK2）也逐渐得到更多的关注。现有研究发现，PD患者前额叶皮质中LRRK2蛋白水平明显高于正常对照组，而且其LRRK2蛋白的总量也与疾病的进程相关。有学者证实，人类体脑脊液和尿液中也找到了运载LRRK2的外泌体，这可能为进一步诊断PD提供新的方向和思路。
3.3外泌体与其他神经系统疾病
与AD和PD这两类神经退行性疾病不同，朊病毒病是一种具有传染性的神经退行性疾病。异常的朊病毒蛋白PrPsc是一种可以通过外泌体播散的传染性颗粒，它可造成脑组织大量海绵状空泡形成，导致神经元死亡。Fevrier等研究证实运载PrPsc蛋白的外泌体不仅可以感染神经细胞，还可以感染非神经细胞。而Bellingham等更进一步发现，被朊病毒感染的神经细胞分泌的外泌体中一些miRNA表达会有差异性变化，而这些外泌体miRNA与一些神经系统疾病相关，如miRs-29b、128a和146a等。无论是运载PrPsc还是差异性表达的miRNA都表明外泌体在朊病毒病的发病过程中发挥重要作用。除了慢性神经退行性病变，外泌体也参与一些急性脑炎症反应的病理生理过程。
创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）在早期以急性脑损伤为主，后期则表现为一些慢性神经退行性疾病的症状，如运动、认知能力受损、伴随有焦虑、情绪情感行为变化。但在这两个阶段过程中，神经炎症反应都发挥重要作用。急性损伤期的神经炎症反应如果持续存在不仅会引起弥漫性轴索损伤、脑组织肿胀、神经细胞大量死亡，还会导致后期神经功能进行性减退、神经细胞延迟死亡。因此，如何减轻TBI急性神经炎症反应成为目前治疗TBI的一个热议话题。目前由间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分泌的外泌体成为研究的热点。MCSs是一类拥有自我更新、分化潜能的多功能细胞。常被用于研究一些非再生组织，如神经组织的细胞替代治疗。
但MSCs调节组织再生的主要机制并不是细胞移植，而是基于蛋白组学的旁分泌途径，而源于MSCs的外泌体就是其中一类有生物活性的分泌因子。与其他类型细胞相比，MSCs能大量分泌外泌体，而且其外泌体的形态、功能及分离储存条件也没有很大区别。与其他类型细胞分泌的外泌体相同，MSCs分泌的外泌体也可装载不同的蛋白和miRNA，从而参与细胞间的信号交换和受体细胞的周期调控。但在不同环境下，源于MSCs的外泌体所携带的信号分子会不同。如在大鼠脑中动脉栓塞模型中，与对照组相比，模型组脑组织中MSCs分泌的携带miR-133b的外泌体会明显增加；另一项研究也显示，将小鼠骨髓MSCs进行缺血预处理，其分泌的携带miR-22外泌体会明显增加，而这些携带miR-22的外泌体可以通过靶向调节Mecp2蛋白抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌纤维化。
在TBI治疗方面，Zhang等首次将MSCs分泌的外泌体静脉注入TBI大鼠体内，观察发现MSCs分泌的外泌体可以减轻TBI大鼠脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，抑制炎症反应，促进神经功能恢复。由于MSCs分泌的外泌体具有纳米尺度、低免疫性、高效通过血脑屏障、有效运输生物活性分子等特点，未来很有可能成为TBI神经炎症反应治疗的新靶点。但其具体的细胞和分子机制仍需要进一步探索。
神经炎性疾病治疗过程中的一个重要障碍是没有有效的载体将药物转运通过血脑屏障。而外泌体因具有低免疫性、先天稳定性、高递送效率和穿过血脑屏障等特点，可以成为神经炎性疾病理想的药物运载工具。Sun等首次将具有抗炎效应的姜黄素包裹在外泌体中用于干预活化的髓样细胞和治疗脂多糖诱导的脓毒症大鼠模型。结果显示，将姜黄素包裹进外泌体可以增加姜黄素的溶解度、稳定性和生物可利用度；而与单独使用姜黄素和脂质体包裹姜黄素相比，外泌体包裹的姜黄素更能抑制活化的单核巨噬细胞产生的炎性因子并减轻脂多糖诱导的脓毒症大鼠的肺损伤。
基于这些发现，Zhang等继续利用外泌体包裹的姜黄素经鼻给药干预脂多糖诱导的大鼠脑炎症反应模型和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导的大鼠实验性自身免疫性脑炎。结果显示，经鼻给予外泌体包裹的姜黄素也能迅速转运至大鼠脑内，并诱导活化的小胶质细胞凋亡，延缓大鼠实验性自身免疫性脑炎的进展。这也为神经系统炎性疾病的用药和治疗提供了一个新思路。除了运载药物，外泌体也被用于装载小干扰RNA靶向抑制脑内特定基因。Alvarez-Erviti等证实，树突细胞分泌的外泌体可以转载小干扰RNA抑制脑内神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞中的靶基因。而Liu等则利用外泌体包裹μ受体小干扰RNA技术通过抑制小鼠脑内μ受体mRNA和蛋白水平改善小鼠吗啡成瘾的症状。
但想要将外泌体真正投入临床使用仍有一些问题需要解决：①进一步提高靶向运送的特异性；②为了确定给药的频率，需要了解药物包裹在外泌体的生物利用度和半衰期；③外泌体给药的位点的选择；④需要了解外泌体药物对于非靶点效应的潜在毒性。
5.小结
近年来，有关外泌体生物起源、生物功能和生物特性的研究越来越多。外泌体是一种拥有多重生物功能的活性载体，在中枢神经系统炎性疾病诊断治疗的相关研究才刚刚起步。考虑到外泌体在细胞间物质运输和信号传递的重要特点，相信还会有更多的研究关注不同的信号分子通过外泌体在疾病演变过程中所起到的诊断以及治疗的作用。而对外泌体作为生物标志物和未来治疗靶点的研究也会为进一步理解神经系统炎性疾病的发生、发展提供全新的视角。
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