撰文 | 玉壺
電壓依賴蛋白通過改變自身構象來對細胞膜上的電壓變化做出反應。這個過程由電壓傳感器介導，該傳感器是一種有四個跨膜螺旋結構域的蛋白。在電壓門控的離子通道中，電壓傳感器控制孔的門。大多數電壓門控離子通道，例如Na+、Ca2+和Kv1-Kv7 K+通道，在細胞膜去極化時打開(即當細胞膜內的電壓相對於細胞膜外為正時，靜息狀態下細胞膜電位外正內負)。關於這類電壓門控通道的研究主要集中在機械力學上。超極化激活的環核苷酸門控通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gatedchannel, HCN channel）是一種罕見的電壓門控陽離子通道，在細胞膜超極化時(即當細胞膜內的電壓相對於細胞膜外為負時)，該通道就會打開【1】。此屬性賦予HCN通道具有起搏器的活性【2】，所以有時又被稱為起搏器通道。HCN通道位於心臟和神經系統中，通過起搏器行為控制生理過程。
目前，有關於這類超極化門控離子通道的研究還很少。HCN通道中的四個相同的電壓傳感器的結構與去極化門控通道中的電壓傳感器很相似
【3】。尤其是，S4螺旋上每三分之一位置攜帶的正電荷氨基酸和門控電荷轉移中心(正電荷通過它在膜上的傳遞是守恆的)這些基本特徵都是相似的【4】。雖然所有的電壓傳感器在結構上都是相似的，但是它們附著在孔隙上的方式是可變的。到目前為止，電壓門控離子通道可分為兩類：結構域交換和非結構域交換。結構域交換指的是電壓傳感器靠在由相鄰亞基構成的孔隙單元上，Na+、Ca2+和Kv1-Kv7 K+通道都具有結構域交換的電壓傳感器。結構域交換需要一個S4-S5連接螺旋，與膜平面平行；連接螺旋共有四個，每個亞基一個，環繞孔隙的門。S4-S5連接器被認為是一個槓桿，能將S4螺旋運動轉移到門上（圖一）【5,6】。
圖一
HCN通道中的電壓傳感器不是結構域交換的，因此不存在螺旋型S4-S5連接器。因此，在HCN通道中，S4螺旋傳遞到孔隙的運動方式肯定是不同的。需要明確的是，一個非結構域交換的離子通道不一定要在膜超極化時打開。例如電壓門控的K+通道Kv10-Kv12和HCN通道一樣，屬於非結構域交換的電壓傳感器，但是它們在膜去極化時打開【7,8】。因此，HCN是一個不同於已經熟悉和廣泛分析的電壓門控Na+、Ca2+和K+通道的電壓門控通道。首先，HCN通道在膜超極化時打開，其次，電壓傳感器不是結構域交換的。那麼，在HCN通道中，S4螺旋傳遞到孔隙的運動方式到底是怎樣的呢？
2019年11月28日，來自美國紐約洛克菲勒大學霍華德·休斯醫學研究所的Roderick MacKinnon教授帶領的團隊Cell 雜誌上發表題為“Voltage Sensor Movements during Hyperpolarization in the HCN Channel” 的長文，他們利用金屬交聯技術結合冷凍電鏡技術確定了HCN通道在超極化狀態下構象的具體結構，並發現了超極化下S4螺旋運動的具體機制。
在沒有外加電場的情況下，HCN通道中的電壓傳感器採用去極化時的構象，孔隙閉合【3】。既然要研究HCN通道在超極化構象下打開孔門的機制，第一步就是獲得穩定的超極化構象結構。使用傳統的化學交聯劑來穩定構象的嘗試都會因交聯的位置而產生偏差。本文最終引入金屬親和交聯法，利用離子通道的方法來測試當通道門打開時，通常彼此接近的位點之間是否形成了化學交聯。在電生理試驗中實時監測交聯的形成速率。如果交聯鍵的生成速率是以通道門控時間尺度依賴的方式，並被控制門控的相同的變量所調控，那就說明，交聯的位點由孔門臨近的殘基形成。作者在早期研究的基礎上，將半胱氨酸殘基引入門控電荷轉移中心（一個位於電壓傳感器中心的氨基酸群，包括一個苯丙氨酸和幾個帶負電荷的氨基酸）區域兩個相互接近的位置。在該研究中，他們提出，當S4螺旋移動時，精氨酸或賴氨酸殘基進入電荷轉移中心，一次一個，並穿過膜。在HCN通道中，S4上的“每第三位”氨基酸之一(幾乎總是精氨酸或賴氨酸)恰好是絲氨酸。於是他們將絲氨酸突變為半胱氨酸(S264C)，並將門控電荷轉移中心的一個殘基突變為半胱氨酸(F186C)。在去極化HCN通道的結構中，這些氨基酸被完美地分離了15個Å。然後他們檢測這個雙半胱氨酸突變是否能引入門控-狀態依賴的金屬親和力交聯。在全細胞膜片鉗記錄中，HCN突變體F186C/S264C通道以電壓和時間依賴的方式打開孔門，這與野生型HCN通道類似。在這些實驗中，細胞膜一開始保持在0 mV（能令通道關閉的電壓）。當膜超極化時，HCN通道以時間依賴的方式打開。但是，當向細胞外溶液中加入100 mM鎘離子（Cd2+）時，依賴於時間的門控消失，通道似乎被鎖在了打開狀態。當Cd2+從溶液中移除時，通道恢復到野生型門控行為。這些影響取決於在186和264位置的半胱氨酸殘基。交聯的形成是依賴於孔門狀態的，並且與通道門控時間尺度相一致。在該實驗中，Cd2+被使用了兩次。在第一次添加時，細胞膜保持在0 mV，經過兩次脈衝，幾乎所有通道都被鎖定打開。在清洗後第二次添加Cd2+時，只有30%的通道在第一次開始脈衝時被鎖定打開。這些結果表明，當超極化打開通道時，Cd2+交聯迅速發生，而當通道關閉時，其交聯速度要慢得多。近80%的交聯反應發生第一次添加Cd2+的第一次和第二次脈衝之間。這些實驗結果說明，Cd2+交聯的形成發生在通道打開的時間尺度上。
滿足這些標準後，他們表達並純化半胱氨酸突變體通道，並在Hg2+存在下利用冷凍電鏡術(Cryoelectron microscopy,cryo-EM)測定其結構。與野生型HCN通道結構相比，S4螺旋向細胞質側移動，即從264位置到靠近門控電荷轉移中心的186位置。這種交聯穩定的通道與超極化膜電壓下的構象相似，被稱為“超極化通道”或“超極化構象,”。也把在0 mV下沒有交聯的野生型通道稱為“去極化通道”。
去極化狀態下HCN通道S4螺旋從原來的位置移動到新位置的時候會發生二次結構變化。作者發現，S4移動過程中，310螺旋雖然仍保持在膜的中心附近不變，但是在兩種結構中由不同的氨基酸形成。當螺旋從胞外向胞內移動時，靠近細胞外表面的α螺旋的氨基酸必須重組到310螺旋里面。同時，當氨基酸從310螺旋開始接近細胞內表面時，它們又必須重組成一個α螺旋。之前也發現，在單個Kv結構中也有從α螺旋到310螺旋的轉變，稱之為“手風琴樣效應”(concertina effect)。許多電壓傳感器中都能觀察到310螺旋【9,10】。310螺旋使S4螺旋上的帶正電荷的氨基酸以每次三個週期性的方式離開脂質環境，進入膜中央附近的門控電荷轉移中心，在那裡，未屏蔽電荷的靜電不穩定性最大。310螺旋比α螺旋纏繞得更緊，並與更高的能量消耗有關。310螺旋在S4位置上的動態移動很完美的解釋了S4螺旋上每三分之一處的正電荷的作用。
隨著S4向超極化構象的位移，門控電荷轉移中心上方的兩個精氨酸殘基R3 (Arg267)和R4 (Arg270)移動到下方。作者還觀察到，S4螺旋分裂成兩個螺旋。包含R4的上半部分螺旋，仍然垂直並穿過膜；R4下面部分的螺旋，則幾乎變得細胞內膜表面平行。螺旋斷口處由Ser272的側鏈進行穩定，它與Leu269的羰基氧形成氫鍵，從而覆蓋了S4垂直段的末端。S4的水平段將R5和R6的側鏈導向細胞內溶液，同時，它將幾個親脂側鏈指向脂膜，將色氨酸指向膜-水界面。將去極化構象中的單個的長的跨膜S4螺旋轉化為兩個分離的超極化構象螺旋，可以明顯地減少將部分S4插入到細胞內的水溶液中所帶來的能量損失。而精氨酸和賴氨酸殘基在水環境中更穩定（能量低）。在此構象中，S4的c端在內膜表面形成一個界面螺旋，似乎在這些有利的和不利的相互作用之間達到了某種平衡。
最終的結果是，S4的新構象使S5螺旋從S6螺旋束上位移一段距離，形成了孔隙的門。為了進一步確認在超極化通道中觀察到的S5的位移是否與孔隙打開有關，作者構建了一個突變體Y289D的結構，該突變體在0 mV時具有很高的打開概率。該突變體的電壓傳感器採用了與野生型類似的去極化構象，結果表明，S5螺旋與超極化通道中相對S6螺旋的偏移方向與野生型相同，只是程度較輕。這兩者中S5的相似偏移表明，S4通過S5相對於S6的位移來控制HCN通道的門。
研究發現，HCN通道在超極化時，S4螺旋從胞外膜表面運動到胞內電荷轉移中心是一個從α螺旋到310螺旋再到α螺旋的過程。在此過程中，310螺旋的位置不變，但是組成的氨基酸成分隨著α螺旋的氨基酸的進入和離開發生變化。同時，S4螺旋會斷裂成兩部分，上面垂直部分保持不變，R4精氨酸殘基下面的部分則由原來的垂直變成與胞內膜表面平行。這種改變使得臨近的S5螺旋改變與S6螺旋的相對位置，從而打開孔門（圖二）。這種α螺旋與310螺旋這種雙螺旋特性是否也是其他非結構域交換電壓門控通道的特徵，還是僅僅是超極化門控通道的特徵，還有待觀察。總之，這篇文章揭示了以前未知的關於HCN通道電壓傳感的機制。以及，不同通道的電壓傳感器可能不會發生相同的構象變化。
圖二：模式圖
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.006
參考文獻
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