04.08 循环肿瘤DNA在肝细胞癌精准诊断和治疗中的应用

单位：复旦大学附属中山医院复旦大学肝癌研究所

肝细胞癌（HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，占全球癌症相关死亡病因的第3位，每年死亡例数＞60万。由于肝炎病毒的盛行，东南亚和南非等地区肝细胞癌发病率最高，我国肝细胞癌发病率及死亡率约占全球的50%。数据显示，肝细胞癌患者5年总生存率仅为15%左右，其中早期局限性肝细胞癌患者5年生存率为28%，区域扩散性为11%，而发生远处转移的患者仅为3%。我国约80%肝细胞癌患者初诊时已发生肝内扩散或远处转移，失去手术切除机会。因此，迫切需要找到有效预防和早诊早治的临床管理措施。

近年兴起的精准医学研究，利用基因组学和蛋白组学等大数据为肝细胞癌早期诊断和精准管理带来希望。2016年1月9日，中国科学院宣布开展精准医学计划，旨在建立一项以基因和表观遗传特征为基础的高效疾病诊治医学模式。其中液体活检是该项目研究的重点之一。液体活检是指通过非侵入性手段对肿瘤等疾病进行精准诊断，主要包括检测血液或尿液中循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTCs）、外泌体（exosomes）以及疾病相关生物标志物如蛋白质、DNA和RNA等。本文旨在详述ctDNA在肝细胞癌精准诊断和治疗中的应用。

1.

ctDNA的发现最早可追溯至1977年，Leon等通过放射免疫法检测173例癌症患者与53位健康志愿者血液样本中游离DNA发现，癌症患者外周血中游离DNA含量较健康人群高，且放疗后其含量进一步增加。1989年，Stroun等从肿瘤患者血浆中检测出肿瘤细胞来源的DNA，并提出肿瘤患者外周血中ctDNA含量增加可能与肿瘤细胞基因组DNA不稳定有关。近年来，随着人类基因组和癌症基因组计划（TCGA）的完成，科学家发现近1000万种癌症相关基因突变。癌症基因突变图谱为ctDNA的研究提供丰富资源，证实ctDNA通过肿瘤细胞的代谢分泌、凋亡和坏死等方式释放至外周循环中，因此携带肿瘤特异性遗传或表观遗传改变，如点突变、拷贝数变异、染色体重排和DNA甲基化异常等。就肝细胞癌而言，在肿瘤发展的不同阶段（包括肝细胞不典型增生期、早期肝细胞癌和进展期肝细胞癌）、治疗前/后和转移复发等动态变化过程中，肝细胞癌患者体内ctDNA的基因特征、表观遗传变异和成分含量等均存在差异。通过检测外周血游离DNA中癌症特异性基因突变及表观遗传变异，能为肿瘤监督管理提供便利。

2.ctDNA与肝细胞癌精准诊断

早期诊断是提高肝细胞癌患者预后的重要因素。目前肝细胞癌早期诊断主要依靠对肝细胞癌高危人群进行定期筛查，包括甲胎蛋白（AFP）水平的检测以及影像学检查如Ｂ型超声CT和MRI检查等。然而，AFP仅在70%的肝细胞癌患者中表达升高，影像学检查也至多能鉴定直径＞1cm的病灶，对于微小肝细胞癌病灶或肝细胞不典型增生病灶目前尚无有效的诊断方法。精准医学研究的目的之一是通过基因和表观遗传数据对高危人群进行风险预测，对疾病进行分子诊断，以期能早期、精准明确疾病分子遗传特征。循环游离DNA有望成为肝细胞癌风险预测的标志物。一项前瞻性纵向研究显示，乙肝病毒携带者外周血中游离DNA相对端粒长度（RTL）与肝细胞癌发生风险相关，且RTL越长，HCC发生风险越高。Li等通过回顾性病例对照研究发现，乙肝病毒携带者外周循环线粒体DNA含量与HCC发生风险相关，且线粒体DNA含量越低，HCC风险越高。这些研究提示，检测循环DNA的RTL以及线粒体DNA含量可作为乙肝病毒携带者肝细胞癌发生风险的预测指标。

肝细胞癌的发生是在各种风险因素作用下，由驱动基因DNA发生突变或表观遗传变异，激活癌症相关信号，诱导克隆形成，从而促进正常肝细胞发生恶性转换。因此，寻找肝细胞癌发生和发展过程中变异的DNA标志物是实施肝细胞癌精准诊断的关键环节。循环肿瘤DNA来源于原发肿瘤的分泌、凋亡和坏死，其DNA突变与原发肿瘤基本一致。因此，在外周循环中检测到肿瘤相关DNA突变，对原发肿瘤的存在具有诊断意义。目前已发现能在肝细胞癌患者ctDNA中检测到的肝细胞癌相关基因突变主要包括TP53、KRAS、NRAS、端粒酶反转录酶（TERT）和CTNNB1基因，能检测到的表观遗传变异主要包括APC、FHIT、p15、p16、E-cadherin、谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）和RASSF1A等基因的异常甲基化。且在ctDNA中发现的基因突变及表观异常基本与原发肿瘤中的突变相一致。因此，ctDNA检测有望用于早期肝细胞癌的诊断。

3.ctDNA与肝细胞癌精准治疗和预后

在实际临床治疗中，临床医师通常依据AFP变化和影像学手段监测肝细胞癌病灶存活或复发情况，再针对病灶进行相应治疗。然而，AFP在30%肝细胞癌患者中表达阴性，影像学手段容易受碘油沉积、肿瘤灌注和操作经验等因素影响，对于治疗时机和方式的把握主要依赖临床医师的经验判断，缺乏明确统一的指标。研究显示，循环肿瘤DNA与肿瘤进展及生存预后密切相关。近期一项监测乳腺癌术后患者ctDNA的研究发现，与传统临床检测手段比较，ctDNA能提前平均11个月（0～37个月）检测到乳腺癌术后患者分子水平的复发，而长期随访无复发患者ctDNA检测阴性，表明ctDNA监测对肿瘤复发转移具有重大意义。Tang等通过绘制肝细胞癌ctDNA监测曲线展示肝细胞癌发展过程中ctDNA含量的变化，在肝细胞癌患者治疗前，肿瘤快速增殖，ctDNA含量也迅速增加，治疗后肿瘤负荷减少或消失，ctDNA含量也迅速降低，而肿瘤复发时，ctDNA含量则再次增加。表明ctDNA变化程度与肝细胞癌进展密切相关，有望作为疗效评估手段和肝细胞癌病灶存活复发的DNA标志物，为治疗时机的选择提供依据。

此外，循环肿瘤DNA还可作为评价预后的分子标志物。多项研究发现，ctDNA在发生血管侵袭的肝细胞癌患者中更易被检测，且ctDNA检出与患者术后短期内复发有关，表明ctDNA可能是肝细胞癌发生血道转移的标志，并提示预后不良。Liao等对肝细胞癌循环肿瘤DNA的研究发现，1例肝细胞癌患者循环DNA中检测出肝细胞癌相关基因突变（c.122C＞T，CTNNB1），但在肝细胞癌活检组织中并未检测到，这表明传统组织活检由于肿瘤异质性的原因，在反映肝细胞癌基因突变情况方面存在一定局限性，而ctDNA能克服肿瘤组织内部异质性所造成的检测误差，更精准地评价预后。因此，术前检测肝细胞癌患者ctDNA基因突变可有望作为预测术后复发、转移及生存期的生物标志物应用于临床。

4.ctDNA研究面临的挑战

尽管ctDNA在肝细胞癌精准治疗中有巨大的应用前景，但面临的挑战也不容忽视。癌症体细胞变异是ctDNA检测和分析的基础，ctDNA变异反映肿瘤的情况。然而，肝细胞癌具有高度异质性，不同于乳腺癌或肺癌具有多个决定肿瘤生物学行为的遗传变异标志分子，HCC缺乏明确的基因和表观遗传特征，且ctDNA中单个基因异常的检出率极低，这些都限制其在肝细胞癌精准诊断中的应用。因此，不推荐单独使用ctDNA浓度或单基因突变及甲基化异常进行HCC诊断，与AFP联合可提高诊断精准度。近期，TCGA肝细胞癌研究项目成果在Cell杂志上发表，363例HCC肿瘤样本全基因组深度测序分析发现多种HCC相关分子突变或甲基化异常，包括TP53、CTNNB1、Axin1、ARID1A、ARID2、LZTR1、EEF1A1和SF3B1等，并发现多条信号通路可能成为潜在治疗靶点。该研究还整合多个平台大数据进行聚类分析，从基因层面确定肝细胞癌预后相关的3个亚型。这些数据可能为HCC患者ctDNA检测分析和临床应用铺平道路。近年来，基因技术迅速发展，ctDNA检测方法也层出不穷，主要包括Sanger测序、焦磷酸测序、二代测序、癌症谱深度测序、实时pCR、数码pCR分析和扩增阻滞突变系统（ARMS）等。但由于受到癌症患者血浆ctDNA含量低以及肿瘤相关炎性反应细胞死亡产生大量片段“背景”DNA等因素影响，目前的ctDNA检测方法常常无法有效从循环游离DNA中检测到有临床应用价值的ctDNA。进一步发展生物信息技术、提高检测敏感度对ctDNA临床应用具有重要意义。

5.结语

综上所述，ctDNA在肝细胞癌精准医学方面的应用前景主要包括以下3点：（1）对肝细胞癌高危人群进行ctDNA动态监测有助于临床医师从分子层面精准预测个体肝细胞癌发生风险，提高对肝细胞癌高危人群的认识和监督管理效力，并对早期肝细胞癌进行精准诊断分型；（2）检测ctDNA可作为肝细胞癌靶向药物的分子标志，指导临床用药，判断治疗效果；（3）ctDNA可作为治疗后复发的分子标志物，并监测肿瘤异质性，为治疗时机和方式的选择提供依据。但肝细胞癌具有高度异质性，缺乏明确的基因和表观遗传特征，且肝细胞癌患者血浆ctDNA含量较低，这些导致肝细胞癌ctDNA研究面临巨大挑战。进一步开发先进的生物信息技术平台，并联合检测CTCs、外泌体、蛋白质、DNA和RNA等多种生物标志物，对肝细胞癌精准诊治有重要意义。

节选自：《实用肿瘤杂志》2018年第33卷第1期