编译 | 小白薯

今年，Nature Structural & Molecular Biology杂志推出了专栏聚焦真核细胞转录，以纪念RNA聚合酶发现50周年。该专栏包括了1篇综述文章和3篇观点文章，另外Nature杂志也有1篇相关的综述文章（敬请关注BioArt稍后的报道）。BioArt首先选择了由加州大学圣地亚哥分校的James T. Kadonaga教授发表在Nature Structural & Molecular Biology的观点文章The transformation of the DNA template in RNA polymerase II transcription: a historical perspective进行了编译，以飨读者。

RNA聚合酶I、II和III的发现开辟了基因表达的新时代。在这篇文章中，James结合自己实验室的发展，回忆了DNA模板在RNA聚合酶II转录过程中发生了由裸露到染色质结合的转变这一发现的历史过程，强调了这些研究揭示了转录因子与染色质共同调节基因表达的机制。

幸运的是，科学就像它所属的那样，不受时间和空间的限制。它属于世界，也不在乎国家和年龄。我们知道的越多，就越感到自己无知，也就越知道不知道的越多。在哲学中，马其顿英雄的情感永远不会适用—总会有新的世界去征服。

—Sir Humphry Davy在皇家学会之前发表的话语

（1825年11月30日）

Humphry Davy爵士这一句话给人的启发很大。他对科学的贡献非常之多，包括首先分离和鉴定钾、钠、钙、镁和其它元素，以及发现由此产生的奇怪效果的气体—一氧化二氮（他称之为“笑气”）。在这个简短的历史回忆录中，我（注：作者James）描述了一段小而有启发性的旅程，这个阶段遵循Humphry Davy爵士的引用观点。这项工作是关于DNA模板在RNA聚合酶II转录过程中的生化性质的分析。在这些研究过程中，我们研究越深，就越能意识到我们还有更多的东西要学习。

阶段1：裸露的DNA模板和染色质早期研究

在发现RNA聚合酶I、II和III之后【1】，关键的进展是发展了能够介导启动子指导的转录起始的生化系统（比如RNA聚合酶II的例子【2】）。这些系统能够很好地与纯“裸露”的DNA模板结合使用，在分析过程中可以很好地工作。

此后不久，科学家开始探索染色质模板的转录特性【3,4】，证明了核小体的转录抑制作用。在涉及启动子指导的转录起始实验中，转录需要在核小体组装之前将一种（或多种）转录因子预先结合到模板上。预装配染色质的失活可能是由于核小体在转录条件下的固定性导致（染色质动力学是一个重要问题，下面将讨论）。几乎在同一时间，科学家对酿酒酵母的遗传研究，独立地证明了染色质抑制转录的结论。例如，组蛋白H4的敲除或突变会导致基因活性的去阻遏

阶段2：通过序列特异性转录因子的激活与抗抑制

在20世纪80年代早期，与启动子和增强子结合的序列特异性转录因子（sequence-specifictranscription factors，ssTF）的发现，导致了它们在细胞内和细胞外众多功能的发现【6】。在生化研究中，似乎许多ssTF能够用现有的系统激活转录，这些系统由细胞粗提取物（请注意这一点在下面阐明）和裸露的DNA模板组成。这些发现导致了大家普遍认为的ssTFs增加内在转录过程的速率或效率（'true activation '；图1），且染色质对转录调控并不是十分重要的印象。

与该模型相反，我实验室的结果表明，GAGA因子（一个果蝇的ssTF;也称为'GAF'）不会增加转录量，反而会抵消通常的抑制活动【7】。我们纯化了这种阻遏物，发现它是组蛋白H1—一种非序列特异性核小体和DNA结合蛋白，通常与转录抑制有关【8】。我们进一步观察到转录因子Sp1和GAL4-VP1625（一种合成的激活因子，融合了疱疹病毒VP16激活区域和酵母GAL4DNA结合域），可以抵抗组蛋白H1介导的抑制并增加转录的速率和效率。我们用“抗抑制（antirepression）”来描述ssTF对染色质或组蛋白H1介导的抑制的缓解（图1）。

我们还发现大多数体外转录提取物，包括广泛使用的核提取物【7】，含有高水平的组蛋白H1。因此，之前使用粗转录提取物和DNA模板的研究实际上是用组蛋白H1结合的DNA模板而不是裸露的DNA模板去检测的ssTF的特性。我们发现，在没有组蛋白H1的情况下，体外观察不到或很少ssTF有活性【8】

这些发现是有争议的。首先，“抗抑制”假说认为染色质是转录调控的关键组成部分。这一观点与认为染色质不重要的普遍模型形成鲜明对比。其次，天然染色质由核小体和组蛋白H1组成。因此，“抗抑制”模型需要用核小体模板而不是组蛋白H1-DNA复合物进行测试。

因此，我们开始使用核小体模板测试抗抑制模型，所述核小体模板用纯化的天然核心组蛋白和聚谷氨酸重构，其功能类似于核心组蛋白伴侣【9】。该方法产生随机分布的核小体，其在转录反应条件下是不可移动的。然后通过盐透析将组蛋白H1掺入染色质中（那时，尚未开发出用于ATP依赖的周期性核小体组装的酶活系统，也尚未发现ATP驱动的染色质重塑过程）。

这些核小体模板的转录分析显示，Sp1和GAL4-VP16各自能够抵抗组蛋白H1介导的染色质转录抑制【10】。值得注意的是，含有组蛋白H1的染色质模板的转录激活程度（分别为Sp1和GAL4-VP16的90倍和200倍）远高于裸DNA模板的活性（3倍和8倍）。此外，含有组蛋白H1的染色质模板观察到阈值现象和长距离（~1,300碱基对）的转录激活，但在裸DNA模板中没有观察到

总体而言，这些早期研究提供了有价值的信息，但对染色质模板的研究还有很大的上升空间。下一步是结合核小体的移动性和动力学研究。

图1.转录激活的模型

插曲：对染色质研究的停滞

在进入第3阶段之前，我应该提到染色质的研究在20世纪80年代末和90年代初经历了一个低潮。在这个时期，很多德高望重的科学家告诉我，“难道'染色质'意味着'神器'？”“你在浪费你的时间！”这时显然是染色质研究领域的一个低谷。当我作报告时，我经常收到有关研究染色质在转录中的作用是徒劳的评论。我会回答说我们研究染色质，因为它是细胞中模板的自然状态，然后我会反问“这是一件坏事吗？”作为回应，没有人会说它很糟糕，但他们仍然清楚地保留了他们对染色质研究的轻视。这些辩论中提出的一些问题在Paranjape等人发表的综述中有所描述【12】。

后来，为了以一种轻松愉快的方式先发制人地处理这种批评，我为我的讲座的介绍部分制作了两张幻灯片（图2）

图2.关于染色质在转录调节中的观点

阶段3：与S-190提取物组装的动态核小体的周期性阵列

尽管前面的实验已经产生了有希望的结果，但是很明显，体外产生的染色质对在细胞中的染色质来说并不是完美的模型。重组染色质和天然染色质之间的一个明显区别是，大量天然染色质由周期性核小体阵列组成，而重组的染色质含有随机分布的核小体。因此，我们和其他人寻求开发一种ATP依赖的周期性核小体阵列组装方法。那时，ATP依赖的染色质组装的最佳方法是使用由Abraham Worcel实验室开发的非洲爪蟾卵母细胞提取物。然而，这种提取物在平时使用时会令人有些沮丧，因为它需要维持青蛙在一年中的不同季节表现出的可变性【13】。为了克服这些问题，Becker和Wu开发了一种更好的染色质组装提取物方法—试验来自前胚盘果蝇胚胎【14】。我们还开发了一种更大规模的染色质组装提取物提取方法，称为'S-190'—也来自大多数胚盘后果蝇胚胎【15】

重要的是，几乎同时，ATP依赖性核小体重塑因子的活性被发现【16】，两种果蝇染色质组装提取物均含有ATP驱动的染色质重构酶【17】。因此，使用S-190染色质组装提取物，我们能够组装由ATP依赖性染色质重塑因子驱动的周期性核小体阵列—这使得转录激活和染色质动力学的组合分析成为可能。

使用S-190装配系统，我们最初分析了模型转录因子GAL4（1-147，缺乏激活区）和GAL4-VP16（GAL4（1-147）融合VP16转录激活结构域）的特性【18】。使用染色质模板，我们观察到GAL4-VP16的强转录激活，但GAL4（1-147）没有。相反，GAL4（1-147）和GAL4-VP16都能够用裸DNA模板或组蛋白H1抑制的DNA模板激活转录。因此，依赖于VP16活化区的转录仅会在用动态核小体做模板时能观察到。我们还检查了染色质模板的结构，发现GAL4（1-147）和GAL4-VP16都能够指导启动子区域中核小体的ATP依赖性重组。这些发现表明，DNA结合结构域足以进行启动子区域染色质结构的初始重塑，并且转录需要激活区域

基于S-190的系统的一个显着特征是当将GAL4-VP16激活子加入到预装配的染色质中时，可以观察到大致相同量的转录激活，就跟在染色质组装前将其加入裸露DNA一样【18】。这与染色质的动态性质一致。我们还可定性地观察到在组蛋白H1存在或不存在时相似的结果，主要差异在于组蛋白H1存在时转录水平较低。这些发现表明转录调控主要由动态核小体介导，其次才是组蛋白H1。

我们用不同的转录因子和启动子进一步测试了S-190染色质转录系统。我们与Katherine A. Jones实验室合作，分析了人类免疫缺陷病毒1型长末端重复启动子，并能够观察到Sp1与NF-κB p65的转录激活，其中p65具有激活区域，但与Sp1和不具有活性区域的NF-κBp50不同【19】。此外，使用Sp1和NF-κB p65或NF-κB p50，我们观察到染色质结构类似于整合的人类免疫缺陷病毒1型原病毒。因此，通过使用具有天然启动子及其同源转录因子的S-190系统，我们能够重建在细胞中看到的染色质结构和转录调节过程。

我们另外用S-190系统检查了人类雌激素受体ERα的转录特性【20】。这些实验表明染色质如何作为转录过程的组成部分。当人们认为染色质已存在大约10亿年时，这个发现应该不会让人感到惊讶！值得注意的是，染色质在没有激活剂的情况下抑制基础转录，但允许ssTF激活转录。以这种方式，基因组维持在转录抑制状态，但可以通过ssTF的作用在特定基因处被激活。

阶段4：使用纯化的装配因子和定制的组蛋白组装动态染色质

尽管S-190系统取得了成功，但染色质转录系统仍有许多改进之处。事实上，与含有许多未知成分的粗S-190提取物相比，用纯化和已知的组分组装染色质会更好。考虑到这一点，我们将大约7年的时间用于S-190的生化分馏以及装配因子的纯化和克隆。这些努力产生了纯化的重组染色质组装系统。今天，周期性核小体阵列可以通过ATP驱动的运动蛋白（如ACF，Chd1或RSF）、核心组蛋白伴侣（如NAP1或dNLP）、核心组蛋白、DNA和ATP组合

重要的是，在与装配因子的纯化和克隆相同的时间范围内，对组蛋白的共价修饰的研究有了很大的扩展。这些修饰至少部分地作为信号起作用，为染色质的研究增加了另一个维度【22】。在同一时期，还出现了对组蛋白变体（即S期独立组蛋白）的新兴认识。因此，由于多种组蛋白修饰和组蛋白变体具有无数可能的功能，染色质和转录的分析变得极其复杂。幸运的是，在这种情况下，纯化的装配系统可用于产生和表征具有特定组蛋白修饰和变体的染色质。

通过纯化的装配因子，我们和其他人开始进行动态染色质的转录分析。在某些情况下，实验是用天然组蛋白进行的【23】。然而实际上还需要继续努力，终极目标是研究出定制的重组组蛋白组装的染色质【24】。因此，我们现在可以为转录和其他核过程的研究定向服务。

阶段X-1：未来

自RNA聚合酶I、II和III发现以来的50多年中，我们对真核生物转录的理解很大一部分来自生化实验。在这些研究中，染色质模板的使用为转录因子与染色质起调节基因表达的机制提供了新的见解。在这项工作的研究过程中，新的发现经常会开辟新的和尚未探索的领域，如Humphry Davy爵士所述。

什么样的未来？当我想到如何设计一个项目时，我有时会问自己，“科学家们将在50年后如何进行这些实验？”在考虑这个问题时，人们也可以向后看，也可以考虑50年前该领域的状况。对于真核转录，当然，当首次发现RNA聚合酶I、II和III时我很兴奋。我们将在未来50年内走多远我不知道？

我没有尝试回答这些问题。我建议未来可能的方向：合成染色质的产生和使用。在研究人员对自然染色质有了适度的了解后（即对研究正常的染色质感到厌倦时），他们将探索和研究非天然分子，形成具有在天然染色质中不存在的特殊功能的“合成染色质”。该合成染色质将在基因组中的特定所需位置产生，并且易于调节其多样且强大的活性。

好吧，让我们开始吧！这是另一个需要被征服的世界！

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41594-019-0278-y

参考文献

1 Roeder, R. G. & Rutter, W. J.Multiple forms of DNA-dependent RNA polymerase in eukaryotic organisms. Nature224, 234 (1969).

2 Weil,P. A., Luse, D. S., Segall, J. & Roeder, R. G. Selective and accurateinitiation of transcription at the Ad2 major late promotor in a soluble systemdependent on purified RNA polymerase II and DNA. Cell 18, 469-484 (1979).

3 Knezetic,J. A. & Luse, D. S. The presence of nucleosomes on a DNA template preventsinitiation by RNA polymerase II in vitro. Cell45, 95-104 (1986).

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8 Croston,G. E., Kerrigan, L. A., Lira, L. M., Marshak, D. R. & Kadonaga, J. T.Sequence-specific antirepression of histone H1-mediated inhibition of basal RNApolymerase II transcription. Science 251, 643-649 (1991).

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12 Paranjape,S. M., Kamakaka, R. T. & Kadonaga, J. T. Role of chromatin structure in theregulation of transcription by RNA polymerase II. Annual review of biochemistry 63,265-297 (1994).

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21 Ito,T., Bulger, M., Pazin, M. J., Kobayashi, R. & Kadonaga, J. T. ACF, anISWI-containing and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor. Cell 90, 145-155 (1997).

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23 Santoso,B. & Kadonaga, J. T. Reconstitution of chromatin transcription withpurified components reveals a chromatin-specific repressive activity of p300. Nature structural & molecular biology 13, 131 (2006).

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