撰文 | 章臺柳
腫瘤細胞具有快速增殖的特性，需要生物大分子提供能量和生物合成，以實現不斷增殖的需求。營養限制被認為是治療腫瘤的潛在策略，但是腫瘤細胞通過改寫代謝途徑，能夠在營養限制的環境中存活。腫瘤細胞中非必需氨基酸的合成已經被證明能夠阻礙治療效果。例如，谷氨醯胺通過谷胱甘肽的生物合成，能夠支持腫瘤細胞中蛋白質合成增加和抗氧化應激，而且為三羧酸循環提供原料，併產生ATP和合成核苷酸、氨基酸、脂質的前體【1】。在沒有外源谷氨醯胺的條件下，腫瘤細胞可以從頭合成谷氨醯胺，但不能從頭合成天冬醯胺。谷氨醯胺限制抑制腫瘤生長的原因就是不能維持細胞內天冬醯胺的水平，因此降低細胞內天冬醯胺的水平或將是限制腫瘤生長的重要步驟【2】。
天冬醯胺合成酶（asparagine synthetase，ASNS）催化天冬氨酸轉化為天冬醯胺，伴隨著谷氨醯胺脫酰胺反應。急性淋巴細胞白血病中ASNS的表達缺陷導致其對天冬醯胺限制敏感，但是，在ASNS低水平表達的實體瘤中，天冬醯胺限制對其沒有效果
【3】。那麼實體瘤中腫瘤細胞如何對天冬醯胺限制產生抵抗及相關分子機制，目前尚未清楚。2019年11月18日，來自美國的Ze’ev A. Ronai 在Nature Cell Biology上發表了題為Translational reprogramming marks adaptation to asparagine restriction incancer的文章，揭示了黑色素瘤和胰腺癌細胞中，天冬醯胺限制可激活RTK-MAPK-mTORC1通路，進而激活翻譯重編程，增強MNK1、eIF4E的翻譯，MNK1和mTORC1協同增加ATF4 mRNA的翻譯。抑制MAPK能夠破壞ATF4及其靶標基因ASNS的上調，使腫瘤細胞對天冬醯胺限制更加敏感，限制其生長。此外，ASNA的低表達可以用來預測黑色素瘤病人對MAPK通路抑制劑是否響應的預測因子，而且ASNA的低表達和較低的MAPK活性與良好的預後相關。
研究團隊首先在胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等細胞系中敲低ASNS的表達，發現顯著降低天冬醯胺的水平，並且抑制細胞系的增殖，回補L-天冬醯胺能夠逆轉這種表型。同時，ASNS缺失導致GCN2的活化，以及eIF2α磷酸化增加、ATF4蛋白及其靶標基因的表達增加，表明氨基酸響應（amino acid response，AAR）通路被激活。而且破壞GCN2-ATF4通路能夠增強天冬醯胺限制對腫瘤細胞的抗增殖效果。
生物信息分析顯示受體酪氨酸激酶（VEGFR2）、血小板衍生生長因子受體（PDGFRA、PDGFRB）、MAPKKK BRAF、MNK1（MAPK信號的效應蛋白和翻譯起始的調控因子）和Polo樣激酶1（一個Ser/Thr激酶，通過c-RAF磷酸化激活MAPK信號）等被預測與ASNS是協同致死（SL）關係，其中多項與MAPK信號相關。同時失活ASNS和預測的SL基因顯著降低腫瘤導致的死亡。相比於ASNAhi細胞系，ASNAlo對預測的SL蛋白的抑制劑更加敏感。而且，ASNS的表達是預測BRAF抑制劑響應的最強因子之一。單獨的BRAFi能夠抑制黑色素瘤細胞的增殖，但與ASNS缺失聯合能夠更高效。抑制MAPK信號（抑制BRAF、MEK或ERK）破壞了ASNS缺失誘導的GCN2-ATF4通路及ATF4靶標基因的上調。ASNS缺失增強MEK和ERK的磷酸化，形成正反饋機制。ASNS缺失導致細胞內絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸和乳酸水平增加，BRAF或MEK抑制劑能夠抑制這種現象。病人中ASNS和BRAF的同時下調預示著其預後更為良好。綜上，MAPK信號在ASNS缺失誘導ATF4表達及相關表型、代謝變化中有重要作用。
MAPK信號如何調控ATF4表達？黑色素瘤細胞中，ASNS缺陷導致TSC2的磷酸化增加，抑制mTORC1負調控因子TSC2的活性，激活mTORC1信號，而BRAF抑制劑能夠阻斷該表型。mTORC1可通過磷酸化4E-BPs使其失活，促進mRNA 5’帽子結合蛋白eIF4E而刺激蛋白質合成。ASNS缺陷細胞中，敲低eIF4E、抑制mTOR都能夠阻斷ATF4及其靶標基因的上調。進一步分析ATF4的翻譯狀況，發現ASNS缺陷增加ATF4 mRNA的翻譯，而BRAF抑制其翻譯。而且mTORC1的抑制增強ASNS缺失誘導的抗增殖效應。故在ASNS缺陷細胞中，MAPK-mTORC1-eIF4E信號介導的翻譯重編程增強ATF4 mRNA的翻譯。除此之外，翻譯重編程過程增加MNK1、eIF4E的翻譯，導致蛋白含量增加。MNK1能夠通過直接磷酸化eIF4E調控翻譯過程，參與調控ASNS缺陷誘導的ATF4 mRNA翻譯增加，但不參與調控mTORC1活性。
RTKs是MAPK信號的上游，而且協同致死預測中顯示VEGFR2、PDGFRA、PDGFRB是ASNS的SL同伴。在ASNS缺陷細胞中，VEGFR2的轉錄增加，VEGFR2和PDGFRB的蛋白水平增加，而且檢測到VEGFR2和PDGFRB mRNA的翻譯增加。抑制RTKs信號能夠阻斷ASNS缺失導致的MEK1/2、ERK1/2磷酸化增加和ATF的上調。其中敲低VEGFR2尤為有效，幾乎完全破壞ATF4及其靶標基因的上調。所以，RTK信號是MAPK通路的上游調控，確保ASNS缺陷導致的ATF4上調。
最後，研究人員對天冬醯胺限制和MAPK信號抑制劑聯用的抗腫瘤效果進行探索。KPC/B6胰腺癌和NRAS突變黑色素瘤模型中，L-Aase（L-天冬醯胺酶）和MEKi兩者聯用（所使用濃度均不能抑制腫瘤生長）顯著抑制胰腺癌的生長，而且降低腫瘤細胞的增殖，促進凋亡；兩者聯用顯著增強MEKi對癌細胞肺轉移的抑制作用。MEKi有效抑制L-Aase導致的ERK1/2磷酸化增加，ATF4及其靶標基因（包括ASNS）的上調。選取15位黑色素瘤患者，在接受BRAFi 或BRAFi和MEKi聯用治療前取樣進行RNA-seq分析。發現治療反應良好的患者其ASNA的表達顯著較低，而且ASNS的表達對MAPK抑制治療的應答具有高度的預測作用。研究人員進一步收集2群獨立的人群數據——轉移性黑色素瘤接受BRAFi或BRAFi+MEKi治療前、後的配對腫瘤樣本，進行RNA-seq分析，發現對MAPK抑制劑產生抵抗與高表達ASNS相關。
總之，本項研究報道了腫瘤細胞通過RTK-MAPK-mTORC1通路重編程翻譯過程，促進ATF4及其靶標基因的上調，從而適應天冬醯胺限制的環境，並揭示了天冬醯胺限制和MAPK通路抑制劑聯用的抗腫瘤效果，為兩者聯用的臨床應用提供了理論依據，為新型腫瘤治療提供了新的視角。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41556-019-0415-1
參考文獻
1. Altman, B. J.,Stine, Z. E. & Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism tocancer therapy. Nat. Rev. Cancer 16, 749 (2016).
2. Gwinn, D. M. etal. Oncogenic KRAS regulates amino acid homeostasis and asparagine biosynthesisvia ATF4 and alters sensitivity to l-asparaginase. Cancer Cell 33,91–107 (2018).
3. Bachet, J. B.et al. Asparagine synthetase expression and phase I study with l-asparaginaseencapsulated in red blood cells in patients with pancreatic adenocarcinoma. Pancreas44, 1141–1147 (2015).
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