撰文丨李瀟颯、陳佳（上海科技大學生命科學與技術學院）
自20世紀70年代重組DNA技術的出現起，DNA編輯技術不斷髮展並趨於成熟。科學家們可以通過改造特定的基因來研究基因功能、遺傳病的發病機理、開發新藥以及用於基因治療和改良作物等等。真核生物的基因組含有幾千萬至上億個鹼基對，難以在特定的位點展開編輯。鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）、轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）和近幾年出現的CRISPR-Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas）大大促進了真核生物基因編輯的發展。
2018年8月31日，Jennifer Doudna教授以“CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering”為題在Science雜誌上在線發表了一篇綜述，概括了CRISPR-Cas系統的工作原理，全方位地介紹了基於CRISPR-Cas系統的種技術的發展和應用，並展望了CRISPR-Cas技術未來的應用前景。
CRIPSR-Cas系統廣泛存在於細菌中，是細菌的一種適應性免疫系統，可以幫助細菌有效識別和切割入侵的外源核酸。CRISPR-Cas系統可以將外源DNA片段捕獲插入到細菌基因組CRISPR-array中，轉錄產生CRISPR RNA（crRNA）後，引導Cas核酸內切酶識別外源核酸進行切割（圖1）。CRISPR-Cas系統包含三種類型：I型，II型和III型。I型和III型系統較為複雜，需要多個Cas蛋白形成複合物開展切割；而II型系統僅需要一個Cas蛋白即可進行切割，目前廣泛應用的Cas9蛋白就屬於此類型。在CRISPR-Cas9系統中，crRNA與tracrRNA結合後同Cas9形成複合物。複合物中的Cas9識別靶位點臨近的PAM序列，crRNA識別靶位點，並形成穩定複合物；進而Cas9內切酶活性被激活，切割DNA從而產生雙鏈斷裂【1】。其中crRNA與tracrRNA可被人為改造成sgRNA（single guide RNA），進一步簡化了CRISPR-Cas系統【2】。另外，Cas12a（Cpf1），Cas13a（C2c2）等其他類型的Cas蛋白也相繼被發現【3，4】，進一步豐富了CRISPR-Cas系統。
圖1. CRISPR-Cas系統的工作機制
CRISPR-Cas系統和基於CRISPR-Cas的各種衍生技術也廣泛的應用在生命科學和醫學領域。Cas9和Cas12a可以在多種類型的細胞和組織內實現有效的特定基因的敲除，以此研究基因功能；通過結合全基因組篩選，可以幫助新藥開發和小分子活性鑑定。近年來發展出的鹼基編輯器（Base editor）系統，把失去活性或者保留單鏈切割活性的Cas蛋白與核酸脫氨酶連接，可以在不產生雙鏈斷裂的情況下開展單鹼基編輯【5-7】（圖2）。相較於傳統的同源重組技術，鹼基編輯的出現使得CRISPR-Cas系統在鹼基轉換方面的效率大大提高，並有望矯正與疾病相關的鹼基突變。
失去活性的Cas9 （dCas9）結合不同的DNA調節蛋白，可以調控基因表達活性或染色質狀態（圖2）。如結合TET1（DNA甲基化羥化酶）可以特異性催化DNA的去甲基化，從而調節基因的表達。RNA調節蛋白也可通過與失活的Cas13蛋白結合實現對RNA的調控（圖2）。若將調節蛋白換成熒光蛋白，可以對特定DNA或RNA分子進行實時成像（
圖2）。
圖2.CRISPR-Cas系統的應用
此外，有研究發現Cas13 和Cas12a蛋白在切割靶序列之後，可任意切割細胞內其他RNA或單鏈DNA（collateral cleavage）。基於這一特點，張鋒團隊開發出了病毒檢測系統，命名為“SHERLOCK”（Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOKing），實現了快速靈敏的病毒檢測。“SHERLOCK”系統除了包含Cas13以及對應的靶向待檢測病毒的crRNA外，還包含一個切割後可發出熒光的報告RNA鏈 。當這些Cas蛋白識別到靶向DNA鏈時，其collateral cleavage被激活，從而切割報告RNA並釋放可檢測的熒光信號【8】。在第二代SHERLOCK系統中，張鋒團隊進一步增加了Cas蛋白的種類，可以同時檢測多種目標；並利用額外的CRISPR相關酶放大其檢測信號，使得其靈敏度進一步增加【9】。
近期，Science雜誌上發表的兩篇CRISPR相關文章“Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR”和“Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space”分別在CRISPR-Cas系統的應用和Cas蛋白的優化方面為我們提供了新思路。第一篇文章中，George M. Church 團隊利用CRISPR-Cas技術建立了攜帶遺傳條形碼的小鼠，利用不斷變化的條形碼成功追溯了小鼠細胞的發育過程（
Science丨小鼠發育DNA 條形碼的建立
）。而第二篇文章中，Osamu Nureki團隊分析了Cas9與DNA複合物的結構，通過不斷的探索，成功改造出了識別“NG”PAM序列的Cas9，使得Cas9在基因操作上的應用範圍大大增加。
儘管CRISPR-Cas領域發展得非常迅猛，與其相關的技術還有很多問題亟待解決，如脫靶效應、效率不高等。針對這些問題，科學家們一直在尋找新的解決方法，如開發更精確的脫靶效應檢測方法、修飾Cas蛋白或sgRNA從而提高複合物的穩定性、嘗試新的轉染方法（如核注射sgRNA與Cas9複合物）等等。
CRISPR-Cas為我們觀察、調控和編輯基因組提供了更為簡潔和直接的方法，它的出現大大促進了生命科學和醫學領域的相關研究。相信在不久的將來，CRISPR-Cas技術可以更好地應用於臨床研究，推動基因治療的發展。
注：陳佳博士現為上海科技大學生命學院PI，近期連續以通訊作者身份在Nature Biotechnology（2篇）、Nat Struct Mol Biol、Cell Res等雜誌上發表多篇基因編輯技術相關論文（
Nature Biotechnology丨陳佳/黃行許/楊力合作組開發出普適型鹼基編輯器
；
Nat Biotech丨上科大、中科院聯合開發新型鹼基編輯器
；
關乎基因編輯的精準性丨APOBEC3介導的DNA修復在CRISPR/Cas9基因編輯過程中產生突變的新機制
）。
原文鏈接：http://science.sciencemag.org/content/361/6405/866（可點擊文末“閱讀原文”）
參考文獻
1. Hsu, P.D., E.S. Lander, and F. Zhang, Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 2014. 157(6): p. 1262-78.
2. Jinek, M., et al., A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science, 2012. 337(6096): p. 816-821.
3. Abudayyeh, O.O., et al., C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science, 2016. 353(6299): p. aaf5573.
4. Zetsche, B., et al., Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 2015. 163(3): p. 759-71.
5. Gaudelli, N.M., et al., Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 2017. 551(7681): p. 464-471.
6. Komor, A.C., et al., Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016. 533(7603): p. 420-4.
7. Li, X., et al., Base editing with a Cpf1-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2018. 36(4): p. 324-327.
8. Gootenberg, J.S., et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 2017. 356(6336): p. 438-442.
9. Gootenberg, J.S., et al., Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science, 2018. 360(6387): p. 439-444.
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