當前，基因編輯技術走向臨床應用面臨最大的問題可能就是其脫靶風險了。關於CRISPR–Cas9基因編輯技術的脫靶問題，近期有多篇論文的報道引發了強烈關注。
去年，5月30日，Nature Methods發表的一篇文章聲稱“CRISPR-Cas9技術可引發基因組上發生數百個意想不到的的基因突變”（
【聚焦】CRISPR可致數百個位點突變，引入基因治療需謹慎
），引起軒然大波，不過該論文在今年3月份被撤稿（
爭議熱門論文遭撤稿丨特別關注
）；然後今年5月份，Genentech公司的研究團隊在Nature Methods雜誌上發表文章，詳細分析了編輯的小鼠和大鼠身上的脫靶位點（
重審CRISPR的脫靶效應，Nature Methods發文全面分析基因編輯鼠的脫靶位點
）；今年7月份，Bradley及其同事在Nature Biotechnology上發文探討了CRISPR/Cas9在目的編輯位點附近所造成的大片段缺失及其它複雜的重組，該工作也顯示了CRISPR–Cas9技術面臨的另一個安全隱患（
CRISPR編輯技術面臨新的安全隱患——胡家志點評
）。這類文章動不動就大幅影響相關股票的市值。但是不管怎麼樣，進一步深入評估CRISPR–Cas9技術的脫靶風險當前仍然是十分必要的，因為當前並沒有一個充分可靠的能夠鑑定活體脫靶效率的方法。
9月13日，來自瑞典阿斯利康製藥公司的Marcello Maresca與麻省總醫院的J. Keith Joung等人合作在Nature上發表了題為In vivo CRISPR editing with no detectable genomewide off-target mutations的研究成果，針對CRISPR–Cas9基因組編輯的全基因組脫靶效應的高效檢測系統在小鼠身上完成了測試，發現使用正確設計的gRNA並不會帶來任何可檢測到的脫靶突變。該研究成果有望促進基因組編輯從研究到臨床的轉化。
在這項研究中，研究人員描述了一種靈敏度較高的“體內脫靶驗證”（verification of in vivo off-targets，VIVO）系統，可以高效檢測CRISPR–Cas9在生物體中的脫靶突變。
VIVO系統主要分兩步（下圖），第一步是稱為“發現”階段，使用麻省總醫院的J. Keith Joung等人在2017年報道的CIRCLE-seq（ circularization for in vitro reporting of cleavage effects by sequencing）方法檢測體外切割效應【1】，第二步稱作“確認”步驟，小鼠活體中注射gRNA後取出肝臟組織DNA對第一步體外檢測到的可疑脫靶突變進行進一步測序確認是否存在突變。
整個VIVO系統中可會事先識別出潛在的脫靶位點，在基因組編輯後再確認這些位點中是否有位點發生了改變。作者在小鼠肝臟中檢測了該系統的準確度。針對PCSK9基因（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，前蛋白轉化酶枯草溶菌素。該基因發現於2003年，其功能獲得性突變可導致常染色體顯性的家族性高膽固醇血癥，使得LDL受體水平下降，進而導致LDL平升高【2】），研究人員設計了不同的嚮導RNA（gRNA），包括混雜性(可以靶向多位點)的gRNA和特異性更高的gRNA進行實驗。最終研究發現，VIVO系統在使用混雜性gRNA是基因編輯體系中檢測到了gRNA誘導的數十種脫靶突變（包括髮生率僅為0.13%的突變，最高檢測的突變率為41.9%），而正確設計的特異性更高的gRNA並不會帶來任何可檢測到的脫靶突變。
值得注意的是，沒有檢測到脫靶帶來的突變並不意味著染色體沒有出現重排，這個風險本文並沒有觸及，該Nature論文在文末的Note added in proof中提及了不久前那篇NBT論文，詳見BioArt此前的報道：
CRISPR編輯技術面臨新的安全隱患——胡家志點評
。
作者認為，VIVO 為定義基因組編輯在實際應用中的脫靶效應設立了重要標準，並證實了設計出特異性極高的gRNA的重要性。
總的來說，這篇論文在方法上的創新性或許不夠，算得上是2017年那篇Naure Methods的升級版，從體外升級到活體小鼠。然而從其亮點來看，主要有以下幾點：第一，首次證明活體（區別於體外細胞實驗）CRISPR–Cas9基因編輯能夠很強的誘導脫靶導致的突變；第二，證明了CIRCLE-seq測序方法預測的位點有很大的參考價值；第三點就是Cas9位點的優化確實能有效規避脫靶位點。
這篇文章的出現或許對促進基因組編輯從研究到臨床的轉化起到推動作用（是不是又會影響股票市值？），但是回到本文的原點，圍繞CRISPR–Cas9基因編輯技術的脫靶問題仍然需要更多的研究和評估。
感謝北京大學胡家志研究員對本文的幫助！
參考文獻：
1. Tsai, S. Q., Nguyen, N. T., Malagon-Lopez, J., Topkar, V. V., Aryee, M. J., & Joung, J. K. (2017). CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR–Cas9 nuclease off-targets. Nature methods, 14(6), 607.
2. Abifadel, M., et al., Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nat Genet, 2003. 34(2): p. 154-6.
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