撰文、编译 | 十一月
责编 | 兮
基因编辑技术是对细胞中的DNA序列进行精准操作从而改变细胞命运和生物体特征的技术，该技术为提高人类对于遗传学的理解以及遗传疾病的治疗提供了重要的工具。DNA双螺旋结构发现到现在约七十年的时间里，对于细胞和组织中基因组序列以及基因表达模式的决定、分析和改变的生物技术日新月异。尤其是CRISPR-Cas9基因编辑技术的发明，为基因编辑技术的发展带来了革命性的变化。目前，CRISPR-Cas9技术已经被用于操纵培养细胞和原代细胞、编辑动物和植物的基因组，极大地加快了基础研究的步伐，也使得农业和合成生物技术取得突破性进展【1-4】。而现在，我们正在进入一个新的时代，在这个时代中，基因编辑技术将用来失活或者修正病人体内的致病基因，为患有遗传疾病的人们提供挽救生命的治疗方案【5】。
近日，加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna在Nature杂志上发表综述文章，对目前基因编辑技术在临床治疗方面面临的机遇与挑战进行了总结，Bioart将此综述进行编译，以飨读者！
基因编辑技术的应用范围
人类疾病的成因一般都比较复杂，但有一些遗传疾病是来源于单基因位点的突变。比如说囊泡性纤维症、亨廷顿舞蹈症、杜氏肌营养不良以及镰刀型贫血症等均是人类基因组中单个基因突变造成的疾病。目前已知的单基因疾病超过了5,000种，影响范围波及全世界2.5亿人口的健康。其中最普遍的两种单基因遗传疾病是：镰刀型贫血症以及杜氏肌营养不良。
镰刀型贫血症是红细胞中存在单基因突变，编码β-球蛋白的基因HBB中携带了两个拷贝的基因缺陷，而β-球蛋白是形成携氧血红蛋白的中所必需的。该疾病最早是在1950年由Linus Pauling以及他的同事们发现并找到的突变位点，在β-球蛋白中有一个A-T的突变造成谷氨酸变成缬氨酸的替换【6】（图1）。这看起来小小的改变，却造成红细胞变成了镰刀形状进而引发病患血管堵塞、身体疼痛以及危及生命的器官衰竭。目前，在临床方面骨髓移植能够治疗该疾病，但是这要求供体与患者的免疫系统相匹配不能出现排斥反应，而这样的供体对于患者来说往往是可遇而不可求的。理论上，镰刀型贫血症的患者可以通过移除体内造血干细胞以及使用基因编辑技术来纠正β-球蛋白中的突变或者是激活γ-球蛋白的表达来代替缺陷型的β-球蛋白
（图1）。编辑后的细胞可以重新植入病人体内，这些编辑过的造血干细胞可以产生健康的红细胞。 图1 镰刀型贫血症单基因突变以及基因编辑治疗
与其他疾病不同的是，镰刀型贫血症的治疗可以从患者中直接提取细胞进行编辑，这使得该疾病或者其他的血液疾病相对来说通过更容易进行基因编辑而且在基因治疗之后更容易追踪细胞的变化。但大多数的单基因遗传突变引起的疾病需要对体内原位细胞进行基因标记才能纠正与疾病相关的遗传缺陷。杜氏肌营养不良就是其中的代表性疾病之一，因为随着时间的进展骨骼肌会逐渐地削弱和破坏【7】。杜氏肌营养不良的比例大概是每五千个男婴有一个患有该疾病，DMD编码的肌营养不良蛋白主要是维持肌肉的完整性（图2）。随着时间的推移，把病人会逐渐丧失行走能力，最终死于呼吸衰竭和心力衰竭，寿命通常不会超过30年。相较于延缓疾病进展的治疗手段来说，基因编辑技术提供了极大的可能性永久性地恢复病人体内缺失的肌营养不良蛋白。虽然造成杜氏肌营养不良的基因突变的位点超过3000种，但是最常见的还是在DMD基因中。而且有研究表明，恢复约15%比例的正常肌营养不良蛋白就会在临床中表现出病症的好转
【8】。
图2 杜氏肌营养不良的病因及基因编辑治疗
但此并不是随意而为的，对于单基因突变的疾病的治疗要求基因编辑手段的精确性以及安全性要非常高。因此，对用于人体基因组编辑技术的选择也是非常重要的。
基因编辑技术及策略
使用DNA切割酶包括锌指核酸酶（ZFNs）以及为转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）均具有潜在的临床基因编辑的可能性（图3）。这些技术被证明可以用于编码HIV受体CCR5失活【9】、造血干细胞中HBB基因突变改造【10】以及儿童癌症中免疫细胞的编辑【11】等等。而CRISPR-Cas9技术的发展更是为基因组编辑提供了一个更加简单高效的方法（图3）。尽管CRISPR-Cas9诱导的基因编辑几乎在所有的细胞种类中都是有效的，但是如何控制基因编辑结果的准确性仍然是领域内的一大挑战。考虑临床使用的安全性和效率问题，基因编辑技术需要精确、高效并且易于释放到目标组织或者细胞中。CRISPR-Cas9可以用于碱基编辑，基因修改以及转录方面的控制。尽管此基因编辑方式已经在培养的细胞中有了广泛的使用，但是这些还不足以支持该技术在临床方面应用的特异性和可输送性。CRISPR-Cas9在临床阶段的早期应用的实例包括治疗先天性的失明
【12】以及接近于临床应用的肝脏基因编辑【13】，这些初步的实验结果将为CRISPR-Cas9在临床方面的应用提供第一手的人体实验数据。
图3 基因编辑技术
组织特异性运输方式的发展
CRISPR-Cas9基因编辑技术即使在体外有效，也需要适合的、精准的方式将其运送到体内需要基因编辑的组织或者细胞之中。目前在体外、组织中以及体内科学家们曾经尝试过运输方式主要包括以下三种：纳米粒子、病毒载体或者是蛋白-RNA复合物电穿孔技术，这三种方法各有千秋（图4）。目前体外比较受欢迎的运输方式是将Cas9组装进蛋白-RNA（核糖核蛋白，RNP）复合物然后使用电穿孔进行运输。而在体内运输释放过程中，挑战性相对来说更大，一般会采用病毒载体（尤其是腺病毒相关载体）或者是脂质纳米粒子携带Cas9 mRNA以及一个sgRNA进行运输。尽管这是一个不断增加研究和开发的领域，但目前仍然难以确保高效、有针对性地将药物输送到人体所需的细胞中，这大大限制了基因组编辑在人体中进行临床实验的机会。
病毒运载工具包括慢病毒、腺病毒以及腺病毒相关病毒，在运输效率以及组织特异性方面具有一定的优势（图4）。一般来说，腺病毒相关病毒在体内的运输方式更有利一些，因为腺病毒相关病毒具有固有的组织趋向性以及临床可控的免疫原性。而且，在脊髓性肌萎缩和先天性失明的临床治疗方面FDA已经批准腺病毒相关病毒作为基因编辑的临床技术方案，目前临床方面的实验正在进行当中
【14】。但是腺病毒相关病毒也存在一些缺点，首先腺病毒的基因组只能容纳编码4.7kb左右的遗传物质，与其他病毒载体相比容纳量小；第二，长时间基因编辑元件的表达的会出现脱靶效应或者免疫反应；第三，临床方面的使用方法还没有很友好，而且造价也比较高。这些因素都是不可忽视的挑战。
图4 基因编辑技术以及输送方式
纳米粒子可以作为另外一种基因编辑元件运输的方式。其中包括脂质介导的纳米粒子、阳离子介导的纳米粒子。但是有机纳米粒子的运输方式具有一个显而易见的缺点，脂质纳米粒子运输具有细胞毒性，而且细胞特异性会存在一些误差。另外一种是无机纳米粒子，其中纳米金粒子由于其内在的亲和性使得基因编辑分子能够很好的耦合在纳米金粒子的表面。目前关于此方面的研究仍然在加强其定向运输到不同组织和器官的能力。
第三种运输策略则包括电穿孔法，这涉及到用高压电流脉冲细胞，在细胞膜上产生瞬间的纳米级孔隙，这个过程允许带负电荷的DNA或mRNA分子或CRISPR-Cas RNPs进入细胞。虽然目前该方法主要使用在体外细胞的基因编辑元件运输，但是目前已有证据发现电穿孔法可以成功将Cas9运送到动物合子之中【15】。但是电穿孔的实用性总体上来说并不好，因此在大多数体内基因组编辑应用中可能会应用会比较有限。
其实基因编辑元件在体内的运输和释放目前可能仍然是人类细胞基因编辑的最大瓶颈，这一问题推动了多学科交叉促进运输载体的优化。相信在不久的未来，在人体细胞中高效率、高组织/细胞特异性的功能性元件运输方式将会被发明以及进一步的优化以便临床方面的使用。
基因组编辑的准确性与安全性
基因编辑在临床应用最基础的要求是确保基因编辑的准确性与安全性。"临床无小事"，任何用于临床使用的治疗方案都需要慎重，对于每一个病人个体而言，基因编辑的副作用对病人造成的伤害只有0%和100%，因此实验技术进入临床使用需要慎之又慎。基因编辑技术最令人担心的问题就是脱靶效应。尽管这些错误出现的几率很低很低，但是一旦进入临床，低几率也会出现致瘤的可能性。科学家们需要进行仔细的测试，以确保临床环境中基因组编辑的准确性和精确性，并最终通过控制目标位点识别和DNA修复结果来减少或消除脱靶事件的发生。
造成脱靶效应风险的内在因素是由于该技术是基于DNA切割诱导基因编辑的，因此，科学家们希望通过不引入DNA双链切割的方式进行基因编辑。目前，科学家们通过失活形式的Cas9 (dCas9) 与抑制因子或者激活因子融合进行CRISPR干扰或者是CRISPR激活的基因编辑【16】。
而基因编辑的另外一个临床应用方面的障碍就是安全性，安全性问题是关于细菌来源的基因编辑蛋白的免疫原性、预先存在的针对CRISPR成分的抗体引起炎症的可能性以及未知的基因组编辑结果的长期安全性和稳定性的考量。已有的Cas9抗体和反应体细胞在接触CRISPR系统的病人体内可以检测的到，尽管目前尚不清楚这些抗体产生的浓度是否足以触发对于基因编辑酶的免疫反应【17】。在实验而非临床使用中，科学家们发现可能存在的非预期的情况是会造成p53信号通路的失活，这会造成细胞快速增殖以及肿瘤发生。而这种情况目前已经可以通过实验方案优化而避免【18】。陈虎/邓宏魁/吴昊合作团队在2019年曾经报道HIV阳性白血病患者接受CRISPR-Cas9编辑后造血祖细胞移植后，虽然细胞数量不足以缓解HIV感染，但是在移植超过19个月后，基因编辑细胞移植在病人身体中的临床表现没有引发任何的不良结果
【19】。这证明，基因编辑在人体上的应用已没有不可逾越的障碍，而最终发展出安全和有效的人类基因编辑的临床应用方案将指日可待。基因编辑疗法与可遗传性基因编辑
基因编辑的临床潜在应用已经在镰刀型贫血症、肌营养不良以及其他的单基因突变疾病中被视为可能的治疗方式。目前CRISPR在临床方面可以大展宏图的方面是提高嵌合抗原受体T细胞治疗的效果【20】。而且，目前使用基因编辑技术应对退行性疾病也大有可用。对于镰刀型贫血症，潜在的遗传缺陷可以通过标准化的CRISPR基因编辑进行校正，这种模式可以用于许多患者的患病情况，一定程度上简化了临床实验，将进一步降低治疗费用同时也满足患者的治疗需求。
但是，目前开发的所有基因组疗法都是通过体细胞修饰治疗患者体内的疾病。这些治疗旨在作用于接受治疗的患者本人，也是传统的疾病缓解方法。然而，目前关于基因编辑在生殖系统的应用可能会引入遗传变化并将此变化遗传给后代，其安全性、可操作性以及相关的问题都不可小觑。
图5 人类生殖细胞基因编辑
人类生殖细胞基因编辑技术是指在卵细胞、精子以及胚胎中引入的可遗传性的突变的技术。生殖细胞系基因组编辑已经广泛应用于动物和植物，并已被用于人类胚胎的研究之中。但是，当时出现了一份在人类胚胎中进行基因编辑导致女婴出生的报告，引起了轩然大波。正如国际组织所强调的那样，基因编辑技术在人体中的应用必须受到严格的监管。这项工作以及与之相关的关于人类生殖细胞系编辑的讨论提出了一些重要的问题，这些问题影响了科学的未来方向，也影响了伴随任何此类应用而来的社会和伦理问题。
首先，在人类胚胎中使用CRISPR-Cas9的研究已经挑战了目前人们对于DNA修复机制和这些细胞中发生的发育路径的理解。第二，在人类胚胎中进行基因编辑的应用需要专业的人员以及社会的响应，不能肆意而为。考虑到科学、伦理和政策问题，不适合进行生殖系基因组编辑，最终导致人类怀孕。但是，在体外编辑人类胚胎和胚子的生殖系基因组应该在严格监督和捐赠者同意的情况下，适当开展，这一定程度上可以促进未来可能的临床应用的研究，因此不应该完全禁止对该项研究的公共资助。而在人类生殖细胞系中进行基因编辑在未来临床应用中不应该进行，除非完全满足以下条件：1）令人信服的医学原理的解释；2）支持其临床应用的证据；3）符合伦理问题的正当理由；4）透明的公共过程，而且需要征求病人的完全了解和同意。另外，CRISPR-Cas9在人类胚胎中应用的问题是，如何在确保可靠使用的同时推动技术向前发展。展 望
在未来的5-10年内，基因编辑技术用于许多疾病的临床治疗已经备受期待。对许多人来说，这是改变医疗方案的重大机遇，是需要科学家、医生、生物伦理学家以及监管机构的精诚合作，以确保基因编辑在临床应用中的安全性、有效性的重要时代。这对很多病人来说影响巨大，刻不容缓。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41586-020-1978-5
制版人：珂
参考文献
1. Terns, M. P. CRISPR-Based Technologies: Impact of RNA-Targeting Systems. Mol Cell 72, 404-412, doi:10.1016/j.molcel.2018.09.018 (2018).
2. Knott, G. J. & Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science361, 866-869, doi:10.1126/science.aat5011 (2018).
3. Hidalgo-Cantabrana, C., Goh, Y. J. & Barrangou, R. Characterization and Repurposing of Type I and Type II CRISPR-Cas Systems in Bacteria. J Mol Biol 431, 21-33, doi:10.1016/j.jmb.2018.09.013 (2019).
4. Bao, A. et al. The CRISPR/Cas9 system and its applications in crop genome editing. Crit Rev Biotechnol 39, 321-336, doi:10.1080/07388551.2018.1554621 (2019).
5. High, K. A. & Roncarolo, M. G. Gene Therapy. N Engl J Med 381, 455-464, doi:10.1056/NEJMra1706910 (2019).
6. Ingram, V. M. Gene mutations in human haemoglobin: the chemical difference between normal and sickle cell haemoglobin. Nature 180, 326-328, doi:10.1038/180326a0 (1957).
7. Shieh, P. B. Emerging Strategies in the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy.Neurotherapeutics 15, 840-848, doi:10.1007/s13311-018-00687-z (2018).
8. Long, C. et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science 345, 1184-1188, doi:10.1126/science.1254445 (2014).
9. Miller, J. C. et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol 29, 143-148, doi:10.1038/nbt.1755 (2011).
10. Chang, K. H. et al. Long-Term Engraftment and Fetal Globin Induction upon BCL11A Gene Editing in Bone-Marrow-Derived CD34(+) Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Molecular therapy. Methods & clinical development 4, 137-148, doi:10.1016/j.omtm.2016.12.009 (2017).
11. Qasim, W. et al. Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells. Sci Transl Med 9, doi:10.1126/scitranslmed.aaj2013 (2017).
12. Maeder, M. L. et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nat Med 25, 229-233, doi:10.1038/s41591-018-0327-9 (2019).
13. Finn, J. D. et al. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Rep 22, 2227-2235, doi:10.1016/j.celrep.2018.02.014 (2018).
14. Mendell, J. R. et al. Single-Dose Gene-Replacement Therapy for Spinal Muscular Atrophy. N Engl J Med 377, 1713-1722, doi:10.1056/NEJMoa1706198 (2017).
15. Qin, W. & Wang, H. Delivery of CRISPR-Cas9 into Mouse Zygotes by Electroporation.Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1874, 179-190, doi:10.1007/978-1-4939-8831-0_10 (2019).
16. Gilbert, L. A. et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell 154, 442-451, doi:10.1016/j.cell.2013.06.044 (2013).
17. Wagner, D. L. et al. High prevalence of Streptococcus pyogenes Cas9-reactive T cells within the adult human population. Nat Med 25, 242-248, doi:10.1038/s41591-018-0204-6 (2019).
18. Schiroli, G. et al. Precise Gene Editing Preserves Hematopoietic Stem Cell Function following Transient p53-Mediated DNA Damage Response. Cell Stem Cell 24, 551-565 e558, doi:10.1016/j.stem.2019.02.019 (2019).
19. Xu, L. et al. CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia. N Engl J Med 381, 1240-1247, doi:10.1056/NEJMoa1817426 (2019).
20. Porteus, M. H. A New Class of Medicines through DNA Editing. N Engl J Med 380, 947-959, doi:10.1056/NEJMra1800729 (2019).
