文獻速遞
為了確定人類胎盤有無微生物以及人類胎盤微生物是否與不良的妊娠結果具有關聯性，作者通過兩個隊列研究胎盤微生物。結果表明沒有證據顯示大部分的胎盤樣品中存在細菌，除了 Streptococcus agalactiae 以外，結果中獲得的幾乎所有微生物信號來源於分娩和生產或者實驗試劑的汙染。作者認為胎盤的細菌性感染不是妊娠不良結果的常見原因，且人類胎盤中沒有微生物組，但胎盤確實是圍產期獲得 S. agalactiae 的潛在位點，該菌是新生兒敗血症的主要原因。
Keywords: Human placenta, microbiome, pathogens, contamination
Title: Human placenta has no microbiome but can contain potential pathogens
DOI: 10.1038/s41586-019-1451-5
Journal: Nature [IF 43.07]
First Authors: Marcus C. de Goffau & Susanne Lager
Correspondence: D. Stephen Charnock-Jones & Gordon C. S. Smith
Affiliation: Wellcome Sanger Institute, Cambridge, UK
Published: 2019-07-31
研究背景
胎盤功能紊亂與常見的不良妊娠結果相關，而引起胎盤功能紊亂的原因還不清楚。有研究利用測序的方法檢測微生物並推斷胎盤在生理上被不同的細菌群體定植，並且這種定植的微生物種類在健康和複雜的懷孕之間可能有所不同。這與通常的觀點認為胎盤是無菌的形成對比。然而，一些同樣基於測序方法的研究表明，由於汙染導致的假陽性結果導致未能檢測到胎盤微生物組。本文研究了先兆子癇（pre-eclampsia， PE），小於胎齡兒的生產（small for gestational age，SGA）和自發性早產（spontaneous preterm birth， PTB）三種不良的妊娠結果是否與胎盤微生物有關以及尋找證據證明是否存在胎盤微生物組。
研究思路
由於胎盤為微生物量極少的組織，在整個實驗過程防止外部微生物汙染非常重要，文章採用了一些防汙染的措施：
- 取樣點為胎盤終端絨毛，必須無損傷，血腫或者梗塞；用溶解於超純水的 PBS 沖洗組織，-80 度冷凍待用。
- 實驗過程在 2 級生物安全櫃中進行（切取組織，DNA 提取，PCR 反應），切取組織的工具為一次性的鑷子和手術刀。
- 對於整個實驗程序的每個步驟，在同天並行處理每個配對的對照，每對樣品使用相同批次的實驗試劑。
- 為了防止交叉汙染，處理每個樣品時更換手套。
- 整個過程（DNA 提取，引物等分，16S rRNA 基因擴增，文庫構建）使用無核酸的塑料製品（除了試劑盒提供的材料）。
- 每個 DNA 提取試劑盒設置空白對照，且空白對照或陰性對照需要經歷和胎盤樣品一樣的 DNA 提取流程。
研究結果
1.研究隊列
該研究設立了兩個研究隊列，第一個隊列包含了 80 個個體，均為分娩前剖腹產，使用相同的 DNA 提取試劑盒，進行宏基因組和 16S rRNA 測序。第二個隊列包含了 398 個個體，生產方式包含了分娩前剖腹產，分娩時剖腹產和順產，所有樣品使用兩種 DNA 提取試劑盒進行兩次 DNA 的提取，進行 16S rRNA 測序。
圖1. 用於分析的兩個胎盤樣品隊列
2.隊列 1 ：宏基因組和 16S rRNA
隊列 1 的宏基因組樣品明顯可以聚類成 3 個 Group，但並不是按照樣品的表型聚類，而是按照樣品上機測序所在的 run 聚類。樣品檢測到的物種在 Group1 和 Group2 具有高丰度，尤其是 Escherichia coli 和 Phi174。在Group2檢測到高丰度的兩個真核生物（Danio rerio 和 Sarcophilus harrisii）以及 Bradyrhizobium 和 Rhodopseudomonas palustris。通過對樣品中 E. coli reads的分析，發現所有樣品屬於 E. coli 的 reads 與一個 reference genome 高度同源，說明樣品中 E. coli 來源於同一株，可能來源於外部汙染。
圖 2. 宏基因組樣品檢測到的批次效應
通過比較宏基因組和 16S rRNA 測序的信號，發現只有 S. agalactiae 和 D. geothermali 在兩種測序類型中具有很好的一致性，且在陰性對照中沒有檢測到這兩種菌；而其他具有 kappa 值的菌株，雖然在兩種測序類型中出現，但在陰性對照中也能檢測出（Caulobacter, Methylobacterium 和 Burkholderia），或者和其它來源分離的菌株具有非常高的一致性（V. cholerae 和 S. pneumoniae），說明這些微生物的信號可能來源於文庫構建和測序的交叉汙染。
表1. 比較宏基因組和 16S rRNA 擴增測序的主要信號
3.隊列2：重複的16S rRNA
隊列 2 的樣品重複不同試劑盒測序結果顯示：樣品按照試劑盒聚類，不同的試劑盒具有不同的優勢物種；用兩種不同試劑盒測得的高丰度物種缺乏一致性，說明這些物種信號與樣品無關，而與批次相關。常見的 Bradyrhizobium 和報道與早產有關的 Burkholderia 不僅展現了試劑盒效應，在相同的試劑盒中還展現了不同 run 的多樣性。另外，使用不用的 PCR tag 酶，不同的分娩時間同樣展現出批次效應。
圖 3. 16S rRNA 樣品檢測到的批次效應
4.分娩相關信號
生殖道乳酸桿菌、生殖道疾病相關細菌和 S. agalactiae 在不同的試劑盒結果中的一致性較其它實驗室汙染菌高。這些菌在樣品的出現頻率和豐度在不同分娩方式的樣品中存在顯著的差異。生殖道相關的乳酸桿菌和生殖道疾病相關的細菌在順產的個體中出現頻率和豐度最高，在未到分娩期剖腹產的個體中最低，且這種現象和試劑盒無關。通過樣品間的相關分析發現，這些分娩相關的細菌與其它汙染菌一樣，具有較高的相關性，說明這些菌可能是樣品在分娩或者生產的時候發生了汙染。
圖 4. 分娩模式和通過16S rRNA擴增子測序檢測生殖道細菌
5.真實的信號與妊娠結果
符合所有評判標準（獨立於 DNA 提取批次效應，分娩日期和分娩模式，不存在於陰性對照中，樣品相關，在宏基因組樣品得到驗證）的微生物才被認定為真實存在於胎盤中。結果只有S. agalactiae 符合所有的條件，但該菌和樣品3種表型沒有關聯。通過 PCR 在276個胎盤樣品擴增 surface immunogenic protein（SIP） 基因驗證 S. agalactiae 的存在。結果有7個樣品同時在 PCR 和 16S 結果中均檢測出 S. agalactiae，說明該菌可能真實存在於胎盤中。在所有與樣品有關的微生物中，L. iners 和 PE 相關，Streptococcus anginosus 和 Ureaplasma 屬與 PTB 相關。
圖 5. 細菌信號與不良妊娠結果
結論與討論
通過對結果的分析，文章得出了以下幾個結論：
- 胎盤細菌生物量非常少；
- 樣品中細菌 DNA 主要來源於實驗室試劑和設備的汙染；
- 16S rRNA 和宏基因組測序都有能力檢測到極少量的加入的標準品的信號；
- 胎盤組織的樣品在分娩和生產，甚至是解剖胎盤內部的時候都會發生汙染；
- 有力的證據表明 S. agalactiae 在分娩前存在於胎盤中；
雖然檢測到一些表型與表型有關，但文章認為可能是子宮升高導致發生的感染。細菌性胎盤感染不是人類妊娠胎盤相關併發症的主要原因，並且人胎盤沒有常駐的微生物組。確定了人胎盤樣品微生物汙染的五種來源。
M菌 · 筆記
文章在取樣過程嚴格控制汙染，分析過程將檢測到的微生物信號定位到不同汙染來源，最終確定胎盤真實存在的微生物，在通過實驗驗證鑑定到的真實存在的微生物，使得文章結果更加可信。
參考文獻
de Goffau M C, Lager S, Sovio U, et al. Human placenta has no microbiome but can contain potential pathogens[J]. Nature, 2019, 572(7769): 329-334.
撰稿 | Yufen 責編 | NSC
本文系菌探Momics（ID：Momics）原創，歡迎個人轉發分享。其他任何媒體、網站如需轉載，須在正文前註明來源菌探Momics。
