DNA雙螺旋結構
1、 前 言
1.1 基因治療
當前,人類面臨的許多疾病問題都是由於基因缺失或基因過度表達造成的。1968年，美國科學家首次提出了基因治療的新概念，其原理是將表達正常的基因核酸分子（如DNA、mRNA）或有"沉默"作用的外源核酸序列（如siRNA、反義寡核苷酸）導入靶細胞，通過促進正常基因的表達或抑制致病基因的表達，從而達到治療疾病的目的[1]。
廣義上來講，基因治療是將某些遺傳物質轉移到患者體內，使其在體內表達，最終達到治療某種疾病的方法；狹義上來講，它是指用正常的基因進行置換或增補患者體內有缺陷的基因而達到治療的目的[2]。作為一種新型的治療技術手段，它對多種疾病，包括癌症、遺傳性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病的治療有著廣泛的影響[3]。由於基因治療直接解決的是疾病產生的根源問題，且可以選擇性地治療患病的細胞或組織，因而在前沿科學領域得到了極大重視。
1.2 基因治療載體與屏障
基因治療的研究熱點之一是其載體系統的研究與發展，目前主要有病毒性載體和非病毒性載體兩種。儘管病毒性載體轉染效率高，但是它也存在著如導向性差、基因攜帶能力低、免疫原性大和潛在的致感染性等缺陷[4]。相比之下，非病毒性載體具有毒性低、免疫原性低、外源基因隨機整合率低且攜帶基因大小類型不受限制等優點，因此日益成為基因治療研究的前沿熱點。
目前，大多數非病毒性基因載體為陽離子載體，通過靜電作用結合帶負電的核酸分子DNA或RNA而形成納米顆粒。但是，納米顆粒從體外穿過靶細胞膜進入細胞時，會受到一系列的屏障。細胞外主要有：a. 核酸容易被細胞外大量的核酸酶降解; b. 網狀內皮系統能夠非特異性吸附納米顆粒，導致部分納米粒被清除; c. 納米複合物能夠與血清中的物質產生特異性結合[5]。細胞內的屏障主要有：a.納米複合物通過內吞的方式進入細胞，首先要經過早期內含體、晚期內涵體或溶酶體，溶酶體呈弱酸性，同時含有大量能降解核酸的核酸酶；b.在細胞質中，核酸必須從載體上釋放出來到達特定靶點；c. siRNA在細胞質內與mRNA特異性結合，阻止了mRNA的表達; DNA要想起作用，必須穿透核膜進入細胞核[5]。
1.3 刺激響應型載體
如何克服基因遞送過程中細胞內外的各種屏障，發展刺激響應型載體材料用於基因治療是一種有效的解決途徑。不同刺激響應型納米藥物載體能夠對特定的生理環境做出不同的響應，併產生結構的變化實現藥物在致病區域的定向快速控制釋放，從而提高藥物在靶點處的富集，最大程度地提高治療效果的同時降低毒副作用[6]。正文部分將重點介紹pH響應型、酶響應型、還原響應型、ROS響應型、光響應型、溫度響應型基因治療載體材料的研究進展。
Figure 1.3.1 Schematic illustrations summarizing various stimuli employed for controlled release of therapeutic cargos following systemic administration[7]
2、 正 文
根據刺激方式的不同，刺激響應型基因載體材料可分為內源性響應和外源性響應[8,9]。pH響應、酶響應、還原響應和ROS響應都屬於內源性響應，是在靶細胞和組織中自然發生的生理學和病理學變化。外源性刺激是外部應用於生物系統的誘導，常見的有光響應和溫度響應等。
2.1 pH響應型基因載體
由於人體內存在pＨ值梯度,因而pH響應型基因載體的研究最為常見。正常組織的ｐＨ約為7.4，然而腫瘤組織處的pＨ大約為6.5。在腫瘤細胞中，早期內涵體的pＨ值約為6.0，晚期內涵體的pＨ值約為5.0，溶酶體的ｐＨ值介於4.0與5.0之間。因此，我們可以利用這一特點,設計具有pＨ響應的載體實現對DNA/siRNA的控制釋放，從而提高其在腫瘤部位的濃度，最大程度地提高治療效率和降低毒副作用。
pＨ響應型基因載體材料的設計關鍵在於其中所含的pH響應化學鍵，該類載體在酸性條件下不穩定，易發生水解斷裂，致使載體逐漸降解，從而將包載的藥物釋放出來。pＨ敏感型載體所包含的化學鍵包括縮酮鍵、縮醛鍵和順式烏頭醜基鍵等[10-13]。
Figure 2.1.1 A schematic presentation of the preparation of an acid-degradable siRNA-loaded PCL nanocarrier and its acid-triggered release of siRNAs [14]
如圖2.1.1所示，Nguyen等[14]在主鏈中引入縮酮鍵，合成具有酸敏感的脂質體並應用於siRNA的遞送，該基因載體進入MDA-MB-231細胞後，能夠在溶酶體的酸性環境下降解，釋放siRNA，從而達到基因沉默的目的，而且大大降低了載體的細胞毒性。此外，Lee等[15]將肉桂醛通過縮醛鍵連接在聚合物的主鏈上，該聚合物能夠在水中自組裝形成膠束，然後在疏水內核中包入抗癌藥物CPT。該膠束進入到腫瘤細胞後，在酸性的環境中，縮醛鍵發生水解，膠束分散，最終釋放出肉桂醛和CPT。肉桂醛能夠產生具有細胞毒性的ROS，通過損傷DNA使腫瘤細胞凋亡，並與CPT的化療作用結合，產生協同的抗腫瘤效果。
如圖2.1.2所示，近期He等[16]通過設計低pH值響應型納米炸彈的納米顆粒實現了在三陰形乳腺癌新靶點siRNA的高效胞內遞送，實現了三陰性乳腺癌中TP53鄰位基因POLR2A的靶向基因治療，在細胞和動物層面都有很好的治療效果。
Figure 2.1.2 w/o/w core-shell low-pH-activated 'nanobomb' nanoparticle structure[16]
2.2 酶響應型基因載體
酶響應型基因載體是指能夠對細胞內或細胞表面酶的種類和濃度不同做出響應來控制釋放其所攜帶的基因的載體。細胞內存在許多不同種類的酶，如蛋白酶、糖苷酶和脂肪酶等，而且不同組織部位酶的種類和濃度存在巨大的差異。與正常細胞相比，腫瘤細胞由於生長和轉移的需要，會過量表達某些酶。因此可以通過設計具存酶響應性的基因載體實現基因在腫瘤部位的控制釋放[17]。
Figure 2.2.1 Schematic illustration of the potential route for intravenous administration of MMP-2-responsive micelleplex for anti-cancer siRNA delivery [18]
Wang等[18]設計了一種金屬基質蛋白酶敏感的膠束載體，遞送 siRNA 進行腫瘤治療。如圖2.2.1所示，PEG鏈段與具有穿膜活性的兩親性鏈段通過酶響應的肽鏈連接。在血液循環中，PEG修飾可屏蔽正電荷、避免蛋白吸附、延長循環時間，膠束到達腫瘤部位後，多肽鏈被金屬基質蛋白酶切斷，暴露出正電荷的穿膜鏈段，促進腫瘤細胞攝取，實現抗腫瘤治療。
2.3 還原響應型基因載體
研究表明，細胞外空間是氧化環境而細胞內是還原環境，這可以歸因於還原劑濃度的變化。例如，在體液（如血液）和細胞外基質（ECM）中，谷胱甘肽（GSH，一種含巰基的三肽）的濃度約為2 μM。而GSH在細胞內濃度是 0.5-10 mM，且在谷胱甘肽還原酶的作用下保持在恆定水平以維持細胞內高還原性環境。同時，在一些腫瘤細胞中，GSH的濃度高於正常細胞幾倍[19]。人們可利用細胞內外氧化還原環境的巨大差異開發可控的細胞內藥物遞送體系，主要通過在高分子材料遞送載體的主鏈、側鏈或者交聯結構中引入可還原的二硫鍵或聯硒鍵。
Zhang等[20]合成了一個表面修飾了HA的脂質納米顆粒，該納米顆粒的主鏈中含有二硫鍵，當載體遞送siRNA進入A549細胞後，則被該細胞中高含量的GSH降解，釋放siRNA，最終達到增強抗腫瘤效果的目的。如圖2.3.1所示，Xia等[21]合成了主鏈中含有二硫鍵的聚氨基酯遞送Fas-siRNA到幹細胞，載體進入到細胞後，二硫鍵斷裂，釋放siRNA，從而降低細胞的凋亡並減小自身的生物學毒性。
Figure 2.3.1 Intracellular trafficking of Fas siRNA/B-PDA polyplexes for the delivery of Fas siRNA into hMSCs and formation of enlarged spheroids of Fas-silenced hMSCs for ischemia treatment[21]
2.4 ROS響應型基因載體
活性氧（reactive oxygen species, ROS）是指由分子氧轉化而來並具有比分子氧更活潑的化學性質的一類含氧化物。ROS主要包括以下幾類：主要包括羥基自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）、過氧亞硝酸鹽（ONOO-）、超氧化物（O2-）和單線態氧等氧的單電子還原產物[22]。ROS在腫瘤和炎症反應中均具有很高的濃度，因此成為這些疾病的特徵標誌之一。ROS對腫瘤細胞信號通路的調控具有兩面性。一方面，ROS促進腫瘤的發生、發展和轉移；另一方面，高濃度ROS可誘導細胞凋亡、促進細胞衰老和抑制細胞週期[23]。據文獻報道，組織損傷、細胞死亡及病原體感染可引發炎症反應[24]。在炎症反應中，炎症細胞釋放可溶性分子，包括細胞因子、趨化因子和基質蛋白酶，趨使更多的炎細胞到達受損部位，炎症細胞被激活後則會釋放大量的ROS，加劇炎症反應[25]。由於ROS在許多疾病中都有高表達這一特點，研究具有ROS響應性的載體具有重大的意義。
據文獻報道，具有ROS敏感的化學鍵包括，縮硫銅鍵，聯硒鍵，苯硼酸鍵和草酸酯等[26,27]。如圖2.4.1所示，Niren Murthy等[28]合成了一個帶有縮硫酮鍵的微球，然後陽離子脂質體包載TNF-α，形成尺寸較小的納米顆粒，再通過乳化技術把該納米顆粒包載到微球中。這樣，當載體通過尾靜脈注射的方式給藥時，能夠很好地保護siRNA不被降解，並順利富集到炎症部位，最終在炎症部位過多的ROS的作用下，縮硫酮鍵斷裂，微球降解，釋放納米顆粒，且該納米顆粒能夠高效地進入炎症細胞發揮作用。
Figure 2.4.1 Thioketal nanoparticles are formulated from a ROS-sensitive polymer and release orally delivered siRNA at sites of intestinal inflammation[28]
2.5 光響應型基因載體
光不穩定保護基團在光解之前可使被保護分子呈惰性，利用這一方法可實現生物體內核酸的可控濃度、位點和時間釋放, 減弱治療劑的"脫靶"(off-target)現象。
Monroe 等[29]首先報道了光解釋放基因的可能性。他們製備了1-(4 , 5-二甲氧基-2-硝基苯基)-重氮乙烷籠鎖的質粒DNA ,作為光活性基因釋放分子, 但是籠型基團因直接對pDNA 骨架的改性和光解造成的DNA的缺口限制了基因的表達。
在無機載體材料領域，Rotello課題組[30]製備了陽離子納米金粒,這些金粒能與DNA以強靜電方式結合。體外實驗證實,即便在T7 RNA聚合酶存在下, 納米金粒能有效阻止DNA轉錄。這些納米金粒還能有效轉染哺乳動物細胞。為了進一步在時間和空間上控制DNA從載體中的釋放,他們對這些陽離子納米金粒進行了修飾, 使這些粒子具有了一個對光敏感的鄰硝基苯酯鍵, 如圖2.5.1所示。
Figure 2.5.1 Schematic presentation of light-induced surface transformation of NP-PC [30]
這些製得的陽離子光解納米粒子(NP-PC)先通過靜電作用與 DNA 複合, 然後在近紫外光(350nm)照射下, 硝基苯基團連接鍵斷裂,釋放出帶正電荷的烷基胺,同時金粒上只剩下帶負電荷的羧基基團(NP-COOH)。正負電荷的逆轉, 使得 DNA 從金粒上被有效地釋放出來, DNA 體外實驗中轉錄水平得到了恢復。這種 NP-PC能夠有效地將 DNA 運送到細胞核轉染細胞。他們的工作為光調節生物活性大分子用於藥物遞送提供了很好的思路。
在有機高分子載體領域，如圖2.5.2所示，Yin等[31]發展了陽離子多肽共聚物，通過在基因遞送多肽PVBLG-8中引入硝基苯基團，在紫外光或近紅外光的照射下，光響應酯鍵斷裂，通過電荷反轉使多肽產生由螺旋到無規捲曲的變化，促進內涵體逃逸，從而能夠實現高效的基因遞送。
Figure 2.5.2 Light-triggered conversion of the charge and secondary structure of the polypeptide, subsequently facilitating intracellular DNA unpacking, and nuclear transport [31]
2.6 溫度響應型基因載體
通常的溫度響應型載體都由兩部分組成：溫敏性組分和縮合DNA組分。一般,這種載體都是在原有陽離子高聚物載體的基礎上引入溫敏性成分如聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm), 來實現溫敏性與基因載體的結合。這一類載體的特點是當溫度在載體的低臨界溶解溫度LCST以上時, PNIPAAm 鏈段脫水塌陷,更緊密地包裹DNA ;當溫度低於LCST時, PNIPAAm鏈段水化並伸展,促進DNA從緊密的縮合態暴露出來,從而有利於RNA聚合酶與其作用。
劉文廣等[32]通過化學合成方法合成兩親性殼聚糖-接枝-異丙基丙烯酰胺月桂酸乙烯酯(PNVLCS)共聚物, 並考察 PNVLCS 共聚物的溫度敏感性。PNVLCS與DNA形成的複合物的粒徑因電荷比的不同而異:在較低 PNVLCS DNA 電荷比時存在裸露 DNA ;在高電荷比下形成小尺寸納米顆粒, 形態為均一小球狀。溫度變化可引起共聚物載體的相轉變 ,並影響到與DNA的結合程度。當溫度低於LCST(如20 ℃)時, 載體高分子網絡親水,呈鬆散結構,載體與 DNA 之間的作用相對較弱 ;當溫度高於LCST(如37 ℃)時, 共聚物載體鏈段變得疏水,緊密包裹並保護DNA。PNVLCS 成功地將pTracerTM-CMV Bsd lacZVector 質粒轉入 C2C12 細胞內,轉染效率受複合物質量比影響。單純殼聚糖載體的轉染效率比裸質粒DNA的轉染效率高4-5倍, 而溫度敏感PNVLCS共聚物載體的轉染效率可由溫度控制進一步提高, 當基因轉入細胞後, 降低溫度至LCST以下,載體網絡形成鬆散的線團結構, 有助於DNA從複合物中解離(unpacking),並促進基因的表達。
值得注意的是, 通過變溫途徑尚未十分顯著地提高溫度敏感高分子載體的轉染效率, 需要進一步優化低溫時間和親疏水平衡等參數。尤其低溫時間的選擇決定了基因是否在核內外解離, 過早地解離會使基因被酶解, 反而降低最終基因的表達水平。
3、 結 語
綜上所述，本文簡單介紹了pH響應型、酶響應型、還原響應型、ROS響應型、光響應型、溫度響應型基因治療載體材料的研究進展。科研工作者們通過豐富的化學手段設計了各種各樣的基因載體，在細胞層面很多都去得了很好的效果，但是離臨床應用還有一段距離。或許將來在設計基因載體時,可根據需要賦予載體多重刺激響應性, 發揮"智能"載體的協同性,以提高基因治療的效果。
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