益生菌是宿主摄入后能够提高宿主免疫的活的微生物，其调节宿主免疫的机制如图1.1。水产养殖中常见益生菌包括乳杆菌、乳球菌、明串珠菌、肠球菌、芽孢杆菌、气单胞菌、弧菌、肠杆菌、假单胞菌、梭菌等菌株。中华人民共和国农业部在饲料添加剂品种目录（2013）中确认了丁酸梭菌（Clostridium butyricum）可以作为益生菌使用。目前，丁酸梭菌作为肠道内存在的“土著”益生菌，具有产氨基酸，维生素，短链脂肪酸等益生物质，调节机体免疫，维持宿主肠道健康的功能，被广泛的应用于肠道炎症治疗以及作为添加剂应用到畜禽和水产动物的饲料中。
图1.1 益生菌对肠道免疫的调节机制
Fig.1.1 Regulation mechanism of probiotics on intestinal immunity
1.2.1 丁酸梭菌的形态与培养
丁酸梭菌又名酪酸菌，是于1933年被日本千叶医科大学宫入近治博士发现，存在于土壤、人及动物粪便[12]中的梭菌属（Clostridium）芽孢杆菌科的革兰氏阳性厌氧菌。丁酸梭菌菌体大小为0.5~1.7 μm×2.4~7.6 μm，颗粒状，单独或成对出现，或者以短链形式出现，偶尔出现长丝状，孢子为椭圆形。在琼脂平板上生长时菌落直径为1 mm~6 mm，呈圆形至不规则形，颜色为半透明，有光泽的灰白色的凸起结构，最适生长温度为30℃~37℃[13]。丁酸梭菌为严格的厌氧菌，施曼玲等[14]采用封石蜡凡士林和焦性没食子酸的方法培养丁酸梭菌发现菌株长势良好，而未用石腊凡士林封闭的培养基上菌株不生长，该实验证实了丁酸梭菌对氧的敏感性。
丁酸梭菌培养方式通常分为固态培养和液态发酵两种方式。魏伟群分别使用豆粕、麸皮、玉米粉作为丁酸梭菌的固态发酵基质，发现当使用豆粕作为固态发酵基质时，丁酸梭菌生长活菌数为最高，确定了发酵时间为24 h，温度30℃，接种量14％的最佳条件，并通过响应面法筛选出硫酸镁、硫酸铵、麦芽糖和水等4个丁酸梭菌培养基的主要影响因子。夏会丽等[则成功的优化了丁酸梭菌HBUT-01的培养基配方，使其酸胁迫效应得到缓解，并在培养14 h后使活菌数达到9.32×108 CFU/mL，是优化前的2.24倍。徐莹[则通过优化培养基，成功将发酵上清液中生物量提高到之前的4.3倍。
1.2.2 产生益生物质
丁酸梭菌在体外培养过程中，可以分解底物产生乙酸、丁酸等有机挥发酸类（VFAs）及氢气，1,3-丙二醇等物质，而在动物肠道厌氧的环境中则代谢产生丁酸、消化酶、氨基酸、B族维生素以及叶酸等营养物质。其中丁酸既是结肠、肠道上皮组织细胞再生和修复的主要能量来源，又可以提高肠道养分消化率、增加消化酶的分泌[22]。同时丁酸梭菌代谢产生的丁酸能够抑制去乙酰化酶活性，叶酸则参与DNA的甲基化和去甲基化，以此调节宿主的基因表达，并对肠黏膜修复及结肠炎和结肠癌的预防起到积极的作用。研究表明，在罗氏沼虾饲料中添加丁酸梭菌能够增加宿主肠道蛋白酶和淀粉酶活性，Duan等。人也在斑节对虾中得出淀粉酶和胰蛋白酶增高的结论。另外，丁酸梭菌在代谢过程中产生的氨基酸、维生素B和维生素K等物质，能起到促进维生素E吸收的作用，从而补充宿主所需的营养物质。
1.2.3 调节肠道菌群
正常的肠道菌群是肠道黏膜屏障的重要部分，肠道菌群的紊乱极易导致宿主肠道疾病的发生。肠道菌群的稳定是肠道维持健康的首要保证，作为益生菌之一的丁酸梭菌，具有抑制致病菌生长，促进有益菌定植，维持肠道健康的作用。Miao等人的研究发现，用含有丁酸梭菌的饲料喂食BALB/c母鼠，可以减少其后代小鼠粪便中肠杆菌属（Enterobacter）的丰度，显著增加双歧杆菌属（Bifidobacterium）与乳酸杆菌属（Lactobacillus）的丰度（P＜0.05）。在使用丁酸梭菌与双歧杆菌联合治疗慢性腹泻时，患者肠道中出现肠球菌和肠杆菌的减少，双歧杆菌和乳酸杆菌的显着增加（P＜0.05）的现象。Hiromi等[28]在使用抗生素治疗儿童上呼吸道感染或胃肠炎时，同时给予丁酸梭菌的治疗，以防止肠道内双歧杆菌的减少，从而维持肠道菌群的稳定。在体外实验时，丁酸梭菌也表现出了对致病菌的抑制以及促进有益菌生长的作用。
丁酸梭菌对于肠道菌群的调节可能有以下原因：j丁酸梭菌同其他益生菌一样，可以有效的占据肠道中的黏附位点，抑制其他肠道菌群的黏附。Gao等人将丁酸梭菌与大肠杆菌在鸡胚肠细胞共同培养，结果表明丁酸梭菌对鸡胚肠道中大肠杆菌的黏附有抑制作用。k丁酸梭菌代谢产生的乙酸、丁酸等短链脂肪酸（Short chain fatty acid，SCFAs）降低了肠道的pH值，促进肠道黏膜的修复，维持了肠道菌群的稳定。研究显示，当使用乙酸盐喂食小鼠，与对照组相比，小鼠肠道酸性变形杆菌数量增多，减少了肠道生态的失调。同样，当对高脂小鼠喂食含有戊酸脂的食物，其肠道微生物中拟杆菌与厚壁菌的比值增大，表明SCFAs改变了肠道菌群的结构与组成。在水产动物中，Li等人将丁酸盐添加到饲料中喂食草鱼并对草鱼肠道内三种细菌进行平板计数，结果发现：与对照组相比，喂食丁酸盐的草鱼肠道内气单胞菌、大肠杆菌数量减少，但乳酸杆菌的数量增加。l丁酸梭菌的代谢产物既可以作为营养物质促进其他菌群的生长代谢，又可以产生有害物质抑制其他菌群的增殖。研究显示，当丁酸梭菌与艰难梭菌共同培养时，丁酸梭菌可以通过分泌蛋白质以及降低pH值来抑制艰难梭菌的生长及毒性作用。
1.4 丁酸梭菌对宿主免疫的调节
丁酸梭菌属于动物肠道中的“土著”益生菌，和其他肠道益生菌一样具有调节宿主免疫基因的表达水平，增强机体免疫力，维持宿主肠道健康的功能。研究表明，丁酸梭菌可以激活由TLR-2介导的MyD-88非依赖性信号传导通路，提高TLR-2、NF-kB、IL-10、HSP-70等免疫基因mRNA的表达水平，增强宿主免疫水平。将丁酸梭菌喂食仔猪[75]，实验结果显示：丁酸梭菌组的仔猪绒毛高度与隐窝深度的比值及十二指肠和回肠绒毛高度均显著高于对照组（P＜0.05），十二指肠和回肠绒毛高度分别比对照组显著增加15.88%和17.54%（P＜0.05），十二指肠和回肠绒毛高度与隐窝深度的比值显著提高了24.58%和34.59%（P＜0.05）。以丁酸梭菌为饲料添加剂喂食家禽，其免疫水平同样得到显著的提升。刘亭婷等[76]使用丁酸梭菌喂食蛋用仔鸡之后，丁酸梭菌组的十二指肠和空肠的免疫球蛋白A（IgA）阳性物质有效数量显著高于对照组（P＜0.05），表明丁酸梭菌增强了肉鸡的肠道免疫水平。Liao等[77]人的实验结果也表明在喂食丁酸梭菌之后，肉鸡出现超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷草转氨酶（Aspartate transaminase，AST）、谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）活性增高，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）酶活性降低等免疫力增强的表现。
丁酸梭菌代谢的主要产物是丁酸，丁酸梭菌可能通过代谢产生丁酸对宿主免疫进行调节。研究表明，丁酸盐可以增强肠道粘膜屏障作用，能够通过G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPRs）以及NF-κB等炎症相关途径调控宿主炎症反应。Li等人在草鱼饲料中添加丁酸盐，与对照组相比，喂食丁酸钠的草鱼肠道中IL-1β，IL-6，IL-8等促炎因子基因表达水平降低，IL-10，IL-11等抑炎因子基因表达水平升高。Liu等人在鲤中的实验发现丁酸钠对肠道中肠热休克蛋白70（HSP-70），促炎细胞因子IL-1β、TNF-α的表达具有调节作用。
1.5 丁酸梭菌在水产动物中的应用
目前，越来越多的水产从业者将目光投向中草药、益生菌、益生元等无残留、污染小的饲料添加剂中。丁酸梭菌在动物肠道中存在，且具有产益生物质、调节肠道菌群结构和提升宿主免疫的特点，必定会在水产动物养殖中有较大的发展前景。在南美白对虾以及日本沼虾的研究中，将丁酸梭菌喷洒在饲料表面进行饲喂，可以提高虾肠道的消化酶活力，抗应激能力以及调节其肠道菌群的组成。Pan使用肠细胞模型评估丁酸梭菌对嗜水气单胞菌和鳗弧菌两种鱼类病原体粘附能力的拮抗作用，结果显示丁酸梭菌可以抑制这两种病原菌在鱼类肠道的定植。宋增福将使用基因工程改造的丁酸梭菌C_2与基础饲料混匀后制粒喂食鮸鱼，发现丁酸梭菌可以改善鮸鱼的生长，提高肠道消化酶活性，提高血清中溶菌酶活性，促进有益菌生长，抑制大肠杆菌、肠产气杆菌等致病菌的生长。在离体实验中，丁酸梭菌对鱼类肠炎沙门氏菌和副溶血性弧菌诱导的细胞凋亡有着明显的抑制作用（P＜0.05），表明丁酸梭菌对鱼类肠炎沙门氏菌和副溶血性弧菌引发的感染具有预防和治疗作用。尽管目前在丁酸梭菌的应用中，将其作为饲料添加剂用以改善动物免疫力的研究很多，但针对丁酸梭菌对水产动物的肠道菌群结构变化及免疫力变化的研究依旧匮乏。
