ImageJ 入門
1. Image J 是什麼？
ImageJ 是一個基於 java 的公共的圖像處理軟件，它是由 National Institutes of Health 開發的。可運行於 Microsoft Windows，Mac OS，Mac OS X，Linux，和 Sharp Zaurus PDA 等多種平臺。其基於 java 的特點， 使得它編寫的程序能以 applet 等方式分發。 ImageJ 能夠顯示，編輯，分析，處理，保存，打印 8 位，16 位，32 位的圖片，支持 TIFF,PNG, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS 等多種格式。ImageJ 支持圖像棧（stack）功能，即在一個窗口裡以多線程的形式層疊多個圖像， 並行處理。只要內存允許，ImageJ 能打開任意多的圖像進行處理。除了基本的圖像操作， 比如縮放，旋轉， 扭曲， 平滑處理外，ImageJ 還能進行圖片的區域和像素統計， 間距，角度計算， 能創建柱狀圖和剖面圖，進行傅里葉變換。[1]
2. ImageJ 可以做什麼？
概括一下，主要分為以下幾個方面：
A) 圖像的區域和像素統計（大小）。長度，角度。 陽性點密度和數量
B) 光密度或輝度，並製備密度直方圖和線性圖。
C) 兩種蛋白共定位的程度 ( 丁香園有篇專門介紹帖子http://morph.dxy.cn/bbs/thread/18145886?keywords=image%20J#18145886）
D) 卷積，Sholl 分析，傅里葉分析（這些還不會使用）
E) 更多功能
3. Image 界面
界面分為：菜單欄，工具欄和狀態欄。
菜單欄 菜單欄從左至右分別是：
文件，編輯，圖形，處理，分析，插件，窗口，幫助。 文件和 office word 等軟件類似，主要有文件打開，關閉，保存等功能，比較特殊的一個功能是恢復功能（revert），可以直接回到上次保存過的狀態。由於編輯菜單裡的取消功能（undo）只能回退一步，所以 revert 有時會很有幫助。
編輯 Undo, Cut, Copy, Copy to system, Paste, Paste Control.., Clear, Clear Outside, Fill, Draw,Invert, Selection, Options.
圖像 Type（可改變圖片格式，如彩色變灰度）, Adjust, Show info, Properties, Color, Stacks,Hyperstacks, Crop, Duplicate.., Rename, Scale, Transform, Zoom, Overlay, Lookup Tables.
處理 Smooth, Sharpen, Find Edges, Find Maxima, Enhance Contrast, Noise, Shadows, Binary,Math, FFT, Filters, Batch, Image calculator, Subtract Backgroud, Repeat Command.
分 析 Measure, Analyze Particles, Summarize, Distibution, Label, Clear Results, Setmeasurements, Set Scale, Calibrate, Histogram, Plot Profile, Surface Plot, Gels, Tools.
工具欄
工具欄從左至右分別是 4種區域選擇工具，直線選擇工具，角度工具，點工具，魔棒，文字，放大鏡，拖手，顏色吸管，動作宏，菜單宏，繪圖工具等（顏色吸管以後的內容可以變化，通過點擊最右邊的 >> 按鈕選擇需要的欄目。不同的按鈕可以進行測量，畫圖，標記，填充等操作。雙擊左鍵或單擊右鍵可以擴展按鈕的功能，如雙擊文字可以選擇字體和大小等。
4種區域選擇工具
分別是方形，橢圓形，多邊形和任意形狀。選擇之後，這些區域可以進行改變，分析，拷貝等。工具欄下的狀態欄可以顯示座標信息。
直線工具：可以畫直線、分段或任意形狀的線（右鍵選擇線的類型），雙擊該按鈕可以改變直線的寬度。
選擇分析測量Analyse →Measure(or Ctrl+M) 可以記錄線的長度，使用Edit→Draw (or Ctrl+D)可以使直線永久保留。
角度工具：點擊角度按鈕後可以畫相交的直線可以測量形成的角度，在狀態欄可顯示，選擇分析測量Analyse →Measure(or Ctrl+M)，在結果窗口中顯示角度。
點工具：當自動測量（Auto-Measure）開啟（默認是開啟狀態）時，可以在狀態欄顯示圖標所在位置的座標和亮度，也可點擊某點，選擇分析測量Analyse →Measure(or Ctrl+M)，可以在結果窗口顯示上述指標。如果是RGB圖，顯示紅色，綠色和藍色的亮度（0-255），如果是灰度圖片，根據選擇圖片格式8位（8bit）或16位（16bit），數值不同。8位最大值255，16位為65535（圖片格式知識可見下述小知識)
魔棒：魔棒工具和photoshop裡的類似，可以自動發現目標的邊界並勾勒出形狀。當圖像明暗對比明顯時尤為有用。有時可配合閾值(Thresholding)使用。
文字：雙擊文字按鈕可以選擇字體和大小。單擊按鈕並按住左鍵拖出文本框，可以鍵入需要的文字，文字顏色使用顏色吸管來選擇。Edit →Draw (or Ctrl+D)，將固定並永久保留文本。
放大鏡：左鍵放大，右鍵縮小。
拖手工具：當圖片很大超過顯示器窗口時，可以使用拖手工具將感興趣的區域已到顯示窗口中央。按住空格鍵可以暫時用鼠標左鍵來拖動圖像。
顏色吸管：可以設置前景的畫筆或文字的顏色。可以左鍵圖片某處選擇該處的顏色，也可以雙擊按鈕顯示顏色窗口來選擇顏色。 其他工具中有部分是和畫圖有關的工具，如噴壺等。如何使用之基礎知識部分（安裝過程略）[2]
圖片編輯與分析（在編輯圖片前建議拷貝一個副本後編輯）
取消（Undo）：Edit →Undo， 恢復到前一步，不過只能回退一步，這點和photoshop操作是一樣的。
恢復（Revert）：File →Revert，恢復到上次保存後的狀態。 裁剪（Crop）：Image →Crop. 方框選擇工具選好區域後進行裁剪。
清除界外（Clear Outside）：Edit →Clear Outside.將選擇區域以外圖形清除。
相類似Edit→Clear是清除選擇區域內部。
改變亮度對比度（Brightness and Contrast）：Image →Adjust →Brightness/Contrast， 類似於photoshop裡的操作。可以是圖形的明暗對比更明顯或更模糊。（Process →Enhance Contrast.這個選項是自動改變對比度，小心使用）
清除噪點：Process →Noise →Despeckle 或者Process →Filters →Median 此外，Process→Noise 選項裡面還有添加噪點的選項。
旋轉：Image →Transform→Rotate
轉化成灰度圖：Image →Type →8-bit （8位），或16-bit（16位）
小知識：關於圖像的字節位數也稱位元（bit）：由於電腦處理的最終記錄方式只有 1 或 0。 圖片上每個像素也需要最終用 0 或 1 來記錄。比如一個 8 位的灰度圖，每個點記錄的字節位數是 8 位，其最大值就是 2 的 8 次方-1=255。表示的意思是從最黑到最白一共分成 256個級別。如果是 8 位的 RGB 圖，則每個像素點組成三原色紅色、綠色和藍色均分成 256個級別來表示。表示的方式用的是 16 進制。如白色為 ffffff（對應的三色數值均是 ff 即 255）。
閾值（Thresholding）：假設要計算組織或細胞HE染色圖片的細胞數量，可以根據細胞核的數目來確定。具體步驟可以把圖片變成灰度圖，然後設置閾值使得高於某個值的部分凸顯出來，這樣就容易計數個數。操作為：Image →Type →8-bit；Image →Adjust →Threshold；通過拖動標杆來設置具體值，最後選擇apply。紅色的區域最後變成黑色，其他區域變成白色，整個圖片變成二元圖（非黑即白）。還可自動設置閾值：Process →Binary →Make Binary。
測量和計數： 設置刻度：在標尺或其他已知長度的兩點畫一條直線，進入 Analyze →Set Scale ,在設置標尺（Set scale）窗口裡會顯示直線的像素長度，鍵入實際中的長度以及單位。這樣就會在像素和實際長度間建立聯繫。選擇 global， 表示其它圖片也將應用該標尺。
設置測量指標：Analyze →Set Measurements. 可以選擇需要測量的指標。如面積，灰度值等。 測量兩點間的距離：在亮點間直線，狀態欄會顯示相對於水平線的角度和長度。進入Analyze →Measure (or Ctrl+M),在結果欄中顯示，並可複製到excel中。
測量特定區域：使用區域選擇工具畫出特定區域（也可用魔棒選擇），然後測量 Analyze→Measure ，測量內容根據測量指標決定。 計數微粒：將圖片轉化成8-bit灰度圖，然後根據上述設置閾值（threshold），然後進入Analyze →Analyze Particles, 鍵入微粒大小的下限和上限，並且選擇顯示輪廓（Show outlines）和顯示結果(Display Results)。點擊ok，被計數的微粒將顯示輪廓和編號。每個微粒的結果在結果窗口中被顯示。 保存文件：存成Tiff的要比jpeg的畫質損失要少(File →Save As →Tiff)。
5. 如何使用之實例
實例一
條帶灰度值分析（可用於 DNA 電泳或 western blotting 條帶的分析）
操作步驟：
打開圖片，轉化為 8-bit 灰度圖Image→Type→8bit（注：電泳圖片來自網頁）www.ggene.cn/html/protocol/ruanjianjiaocheng/2009/0421/284.html
消 除 背 景 Process→Substrate background 選中預覽（Preview），選擇合適的像素值（本例為 30）。
方框工具選擇並畫出條帶 1，Analyze→Gels→Select First Lane(快捷鍵 Ctrl+1 或數字 1)
在第一個邊框邊緣左鍵拖動移至第二條帶，Analyze→Gels→Select Next Lane (或 Ctrl+2)，重複該步驟，（快捷鍵一直都是 Ctrl+2 或數字 2）
所 有 邊 框 選 擇 完 畢 後 , Analyze→Gels→Plot Lanes (快捷鍵 Ctrl+3 或 3)。提示：Ctrl+3 不能多次按，可改為 Analyse →Gels→Re plot Lanes
Plot Lanes 後將出現條帶的灰度曲線圖，通過條帶所在位置的曲線圍成的面積得出其輝度或密度值。
首先通過直線工具將峰值部分封閉，如箭頭處所示。（也可添加垂直方向的線）
選擇魔棒工具，選中封閉區域，即可顯示其面積，也就是對應條帶的輝度值（圖中2 峰得出的值分別為6166.598 和2995.477，所代表的條帶被窗口擋住了。）
實例二：測量小魚面積（圖中黑色金魚，標尺為原圖片自帶，正規應該放測量工具實物）打開圖片:
轉化為 8-bit 灰度圖Image→Type→8bit直線工具在已知長度地方畫出直線（黃線所示）
Analyze →Set Scale已知長度（Known distance）:5， 單位(Unit of length): cm
設置閾值 Image →Adjust →Threshold
Analyze →Analyze Particles, 鍵入微粒大小的下限（為 5）和上限，並且選擇顯示輪廓（Show outlines）和顯示結果(Display Results)。點擊 ok
結果，由於下限選擇了 5 平方釐米，所以只有大金魚的面積被測量。（右上角的小金魚由於顏色較淺，面積顯示比較小，不到 5)
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Reference
[1]Wikipedia, http://zh.wikipedia.org/wiki/ImageJ
[2]Image Basics(version 1.38), Larry Reinking, http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/pdfs/ImageJ.pdf
