作者/Clifford Lowell教授
4月2號，加州大學舊金山分院（UCSF）實驗室醫學系主任Clifford Lowell教授在ImmunoX Initiative 俱樂部活動做了一個講座，從病毒學、免疫學和人病理學方面對新冠做了個全面分析。
下面再來分析一下這次新冠病毒的傳播路徑
有個非常好的網站叫https://nextstrain.org/ncov/global ，它用種系發生學的方法將全球上傳到GISAID病毒庫的3365個病毒的基因序列進行分析列出病毒的演化關係，數據的時間從2019年12月直到今天，而且還在不斷更新。
Figure21 新冠病毒種系關係以及傳播路徑
上圖的左側就是新冠病毒的種系演化圖，大約有5個大的演化分枝（Clade），右側是病毒的全球傳播路徑。通過用不同的顏色標註，可以清晰看出該病毒的最早起源時間、地點以及響應的傳播路線。
這個圖還可以用其他方式表達，如徑向表達法（圖22）或自由樹表達法（圖23）：
Figure22 新冠病毒的徑向表示，中心是發源地
Figure 23 新冠病毒傳播的自由樹表達
這個網站的數據和可視表達完全是互動的，你可以任意選取時間點來了解當天的病毒演化情況和傳播位置。圖中的顏色表示國家或地區，如紫色代表中國，紅色代表美國，綠色代表歐洲等。
Figure24 新冠病毒演化和傳播的幾個時間點
例如，如果我們選取時間點為2019年12月7號，可以看到病毒從武漢發源。把時間調到2020年1月19號，病毒已經傳到加拿大、美國、澳洲和歐洲。最下面是4月24日病毒的演化樹和在全球傳播的情況。
通過這個可視數據庫還可以看出新冠病毒對有些國家有二次傳播。例如圖25中1月19日傳到加拿大的病毒又傳入美國，又例如傳到歐洲的病毒又通過伊拉克再次傳入澳大利亞。
Figure25 新冠病毒的複雜傳播路線
那麼，我們如何來測試病毒呢？
大部分的測試是對三個病毒基因（RdRp, N和E）做標準RT-PCR反應測試 。標準測試用Taqman 測試法對這三個蛋白基因做擴增。RdRp是基於RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase），位於ORF1ab區，測試就是對其進行擴增看看是否能觀測到，它就是藥靶（drug target）。另外就是擴增測試E（包膜蛋白基因Envelope gene ）和N（核衣殼蛋白Nuclearcapsid ）。
如下圖
Figure 26 陽性測試集中在三個基因序列上
這個方法是我們在中國研發的，但已經在世界各地使用，雖然引物（Primers）可能各地不太一樣，但基本操作都一樣，每個人都懂。現在又出現了一些新的測試方法，這是在危機壓力下催生出來的新技術。例如核酸恆溫擴增技術（Isothermal RPA Assay），估計今天聽講座的人90%都不知道什麼是核酸恆溫擴增技術。這是一種重組酶聚合酶擴增法（RPA法，recombinase polymerase amplification），可以替代PCR測試，剛剛商業化。還有個新技術叫CASPR CAS 12 和 13 核酸測試法。
什麼是核酸恆溫擴增技術（Isothermal RPA Assay）？它的工作方式和標準的PCR測試相同，不妥所依賴的蛋白不同。這個技術涉及的三個蛋白（主要來自噬菌體), 是重組酶（recombinase），單鏈結合蛋白 (single strand binding protein) 和鏈置換聚合酶（strand displacing polymerase）。
這種方法不需要做循環組裝（Cycling），這意味著可以快速用逆轉錄將RNA轉為DNA，在同一個試管加進內生或者外來的核酸酶來進行測試。該方法於2006年首次公佈，現在有多個版本（LAMP，HAD）和引物選擇鍵。
Figure27 核酸恆溫擴增技術
在RPA測試過程中，所要測試的DNA被細胞DNA重組、修復和合成中所涉及的蛋白指數級擴增。引物與目標序列兩頭的引物端（Primer Ends）結合，被聚合酶引入，使得單鏈被單鏈的結合蛋白所穩定，以此獲得擴增。
這一切都是在同一個溫度下發生，所以你不需要做循環（Cycling），這意味著擴增的速度大大提高，即將目標序列在幾分鐘內進行擴增。你可以通過標準的pac-man探針來檢測擴增情況（如圖28）
Figure28 雙標籤帶生物素的探針
或者用帶有生物素（biotin）的探針來檢測擴增子（amplicon)的存在（見圖29），即用一個小的TLC測流來檢測擴增子。
Figure29 TLC 側流測試法
這個技術實在了不起，這就是Abbot剛剛推出的核酸陽性檢測儀背後的技術，這個檢測非常快，只需要5分鐘時間。
Figure30 Abbot公司RPA核酸測試儀
另一種測試方法是所謂CRISPR-Cas 12或13核酸檢測法。
我們很多人知道基因編輯使用的CRISPR CAS９，但沒人知道CAS 12是什麼。這是一種裂解酶（Cleavage Enzyme），來自不同的生物核酸分子雜交。與CAS9不同，它與自己的嚮導RNA（Guide RNA）結合並檢測自己的目標序列以及對靶位進行裂解。於此同時，它啟動一個非特異的單鏈DNA的活動。因此突然間，酶開始降解環境中所有的單鏈DNA（ssDNA）。（見圖31）
Figure31 CRISPR-Cas12 或Cas13核酸測試
這樣你就可以設計一個測試方法，（見圖33）將Cas12及其嚮導DNA用在任何冠狀病毒的核酸序列上，直接與其進行結合，然後放入一個生物素探針中並在測流試條上觀測檢測結果。這很像一個妊娠測試（見圖32）。如果反應足夠敏感，也可以在一個玻璃試管中做。
這種測試方法很快就會出來。這也是我們UCSF實驗室的Charles Chu小組做的。
Figure 32 側流結果觀測條
Figure 33 CRISPR-Cas 12或13核酸檢測
下面介紹新冠抗體的血清測試：
現在出來了很多測抗體的血清測試方法，大部分都是針對S蛋白和N蛋白的受體結合域（RBD）做的，用E（包膜）細胞做的較少。這些測試方法大多是酶聯免疫吸附試驗（ElISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），均是根據以往對SARS和MERS的經驗進行研發的結果。目前的測試方法雖然很多，但有效性均可疑，不過技術應該會很快改進並很快進入臨床應用，
在中國用此測試做的結果顯示，幾乎所有的人出現症狀後兩週都會產生抗體響應。（見圖34）
Figure34 抗體測試
上圖中，紅色曲線是總抗體數，紫色曲線是免疫球蛋白lgM，藍色曲線是免疫球蛋白IgG，綠色曲線是與IgM和IgG相對應的病毒核算RNA。我不明白在這個實驗中為什麼IgM和IgG比抗體總數少那麼多，不過也就是一個例子。
歐洲做了一個控制的較好的血清抗體測試，剛剛發表在bioRxiv上。測試所用的血清來自存儲的SARS和MERS病人。圖35顯示了對於新冠和SARS，抗體響應均與病情程度正相關。
Figure 35 抗體響應在新冠和SARS上的差異
Figure36 S或S1域受到SARS, MERS和新冠感染時抗體IgG的響應情況
可見，對於S域而言，抗體LgG對新冠和SARS響應均明顯，但對於S1域，抗體LgG只對新冠病毒有響應。
Figure37 抗體對各種病毒的響應水平
從圖37看，ELISA抗體LgG在S1域上僅僅對SARS和新冠有響應，但對其他病毒毫無響應。H冠狀病毒H微陣產生的抗體對MERS和SARS病毒基本不響應，但對其他病毒卻具有較強響應。
下面這個討論很重要，很多人問：新冠感染後產生的抗體是否有保護作用？疫苗會有用嗎？
要回答這個問題，還得藉助我們對SARS和MERS的瞭解。有一點是確定的：對SARS和MERS，用小鼠和獼猴做的實驗中，預防性和治療性的針對S蛋白而製作的的單抗效果的確很好，其工作機制通常是直接阻斷與S蛋白的結合。實驗中會有些病毒逃逸，所以實驗中常常同時使用兩種單抗來防止病毒逃逸。
有趣的是，Gary Nabel 早在2005年的論文顯示某些單抗蛋白實際上可以啟動S蛋白並加重感染。（https://www.pnas.org/content/102/3/797 Evasion of antibody neutralization in emerging severe acute respiratory syndrome coronaviruses，Gary J. Nabel）研究發現，抗體IgA與MERS病毒有逆相關關係，可是問題是：對於MERS病毒，病人康復後的抗體水平會迅速下降，而對於SARS病毒，抗體IgG在痊癒後的6年中會持續下降。
所以並不能籠統說單抗是好或是壞，這個要具體分析。我們將看到，許多公司會很快做出這些用於消極治療的單抗類型。不過要明白，這些治療性的單抗並不是疫苗，也與免疫無關，這只是消極免疫。如果我們想了解人體康復後對於新冠病毒是不是已經產生了適應性免疫，我們還必須看看關聯性研究的數據。
漿膜的免疫球蛋白IgA水平和MERS病人的病毒活動水平有相關性，問題是，病人康復後抗體水平會迅速下降。事實上，在SARS的流行期間，人們的免疫球蛋白水平IgG水平隨時間會下降。所以真正的答案是，我們並不清楚感染後是否會得到免疫。
不過我們可以看看動物的免疫實驗情況，來了解是否痊癒後會不會獲得免疫，或疫苗究竟會不會起作用。在這次新冠病毒流行之前的SARS和MERS流行期間，我們就對動物做了大量研究。亞單位疫苗或滅活的疫苗在小鼠和獼猴的研究中都被證明很有效，都產生了很好的抗體響應。不過在這這些實驗中，當這些動物再次受到病毒感染的威脅時，情況反而會變糟。這說明體內的疫苗阻礙了這些動物身體的免疫響應，其結果是這些動物變得更容易被感染。這是你完全想不到的。我們現在的理解是，這就是所謂ADE效應（Antibody Dependent Enhancement)，即抗體的依賴性增強效應。對登革熱疫苗而言，這種ADE現象已經被研究的很詳細了。注射過某種類型登革熱疫苗的病人如果被另一種登革熱病毒感染，情況就會變得更糟。
究竟什麼是抗體依賴性增強 （ADE）效應呢？
人體首次感染某種病毒時，會產生高濃度的抗體並將病毒清除。可是人體康復後再次被相關的病毒感染時，就會產生所謂抗體的交叉響應（譯者注：cross-reactive antibody，指的是身體受到某種病毒攻擊時，抗體在其Fab區會產生一種特異的並與該病毒抗原親和的氨基酸序列，但是如果該抗體對另一種病毒抗原也具有親和性的話，那麼當這種病原出現時，抗體也會產生響應。這種對多種抗原產生的抗體響應就被稱為交叉響應）。
對登革熱而言，ADE被認為是出血性反應的原因。登革熱病毒會通過其Fc受體進入細胞，並會試圖進入非溶酶體囊泡（non-lysosomal subcellular compartment）。其機制如下：當病人首次被病毒感染時，體內會產生高濃度的抗體並將病毒清除，也就是說，巨噬細胞吸收了大量溶酶體成份（Lysosomal Component）。但該病人再次被類似病毒感染時，病毒濃度可能並不高，或僅僅產生少量交叉響應。可是，病毒粒子會直接被巨噬細胞中的非溶解酶囊泡所吸收，這些非溶解酶囊泡並不能殺死病毒粒子，而是會讓病毒粒子逃逸到細胞質中，進入其它非溶酶體的囊泡中，這樣就會加強了病毒侵入細胞的能力。（圖38）
很多人擔心這可能正是這次新冠病毒流行所出現的情形，即很多人體內已經有了針對其他冠狀病毒的抗體，這些抗體產生的交叉響應加重了新冠病毒對人體的傷害，這就是ADE現象。我們需要對病人做血清測試，看看病人抗體濃度高是不是會更糟？很多人已經對冠狀病毒有了抗體，這些抗體可能會產生交叉反應。之所以那麼多人出現嚴重的症狀，可能正是ADE所造成的。
另一個問題相關的問題是：為什麼老人被感染後病情更糟？我的猜測是因為他們有較長時間接觸各種其他冠狀病毒，體內容易產生抗體交叉響應。我有個假說，下面會具體分析。
還有一個需要回答的問題是：能用康復病人的血漿（Recovered Plasma Therapy）進行新冠治療嗎？？？天啦，我們對此可要小心！
Figure38 ADE 示意圖
再來談談SARS-冠狀病毒疫苗的研製情況：
人類在疫苗研製方面做了很多努力。亞單位疫苗和滅活疫苗已經過時了，今後將是基於DNA的疫苗。我們會看到有些基於DNA的疫苗已經進入了臨床試驗階段，這些藥物試圖通過改變佐藥（adjuvant）來避免產生ADE效應。顯然，基於DNA的疫苗，或者經過滅活的疫苗會誘導細胞免疫。通過動物實驗我們知道細胞免疫對抵抗冠狀病毒是很重要的，這點我們通過轉基因的小鼠應對SARS病毒的實驗中已經得到證實，儘管轉基因模型可能會導致肺部受損。CD8+1 T細胞響應在獼猴對付MERS病毒上十分重要。
顯然，這是一種DNA病毒疫苗而非經典的亞單位疫苗，或某種經過沸煮滅活的病毒所製作的疫苗。這類疫苗最終會被研製出來，但正如很多人說的那樣，會花很長時間，這需要我們對病毒的病理有更多瞭解。
要想研製滅活的疫苗，必須要明白病毒如何抑制人體的自然免疫響應。說到底，致病一定是天生免疫響應出了問題。這些病毒和其他病毒一樣，有著一個不可思議的工具庫，用來關閉人體的天生免疫響應。
Figure 39 人類冠狀蛋白對天生免疫系統的信號通道產生的影響
西班牙國家生物中心的Enjuanes等2016年在Adv Viral Res雜誌上發表了一篇論文，題目叫：《冠狀病毒的毒性和疫苗研發的分子學基礎》（Molecular Basis of Coronavirus Virulence and Vaccine Development），提出病毒疫苗必須能夠誘發免疫系統的響應，要足夠穩定、安全和具有長期免疫能力。下圖來自本篇論文，解釋了人類冠狀蛋白對天生免疫系統的信號通道產生的影響，或者說病毒是如何關閉了人的天生免疫機制。
冠狀病毒有某種搞亂人體天生免疫響應的基因，會阻礙抗體對病毒的響應並加快病毒複製。病毒的非結構蛋白（Nsp，non-structural protein) I-型會阻斷干擾素（interferon, IFN）響應，從而抑制了蛋白翻譯。Nsp3 有ADR磷酸酶活動，也可能會阻斷IRF。Nsp16阻斷對病毒的RNA識別。SARS的 M蛋白也會阻斷IRAK抗體。
這些數據雖然是針對SARS和MERS所做的研究，但可能對新冠也是適用的。很多非結構蛋白都會阻斷I-型干擾素響應，磷酸酶和脫磷酸酶作為蛋白活性的開關係統，也可能會阻斷I型干擾素響應，有些通過RIG-I機制或MDA5來阻斷近端RNA。有些在轉譯水平上發生作用，阻斷ISG（ interferon-stimulated gene 干擾素刺激基因 ）的表達。有些SARS的M蛋白會在這裡阻斷IRAK（指圖的上部）。所有這些病毒的共同工作機制，就是關閉天生免疫系統對病毒狀態的響應。總之，SARS和MERS病毒會限制人體的天生免疫響應。
病毒感染引起的炎症反應有兩種。一種是致病性的紊亂炎症反應，另一種是正常的保護性炎症反應。圖40清楚地解釋了這兩種炎症的發生過程。
Figure40 病毒感染的炎症反應
對於紊亂的炎症反應，病毒在體內大量複製並推遲了干擾素的響應。炎症的單核巨噬細胞和嗜中性粒細胞滲透大大加強，前炎性細胞因子和趨化因子大幅升高。這些會造成上皮和內皮細胞死亡，增加血管滲透，T細胞和抗體不能產生正常響應，因而也無法有效清除病毒。這樣說產生的後果會造成肺部嚴重受傷，出現急性呼吸窘迫綜合症並導致死亡。
對於正常的炎症反應，病毒在體內只有輕度複製，早期就會出現干擾素響應，炎症的單核巨噬細胞和嗜中性粒細胞只有輕微滲透，前炎性細胞因子和趨化因子也只有輕微上升。這樣，上皮和內皮細胞不會出現大量死亡，血管滲透也很少，T細胞和抗體響應反應良好，因而可以有效清除病毒。如此，病人可以獲得保護性免疫並最終康復。
下圖是對紊亂型天生免疫響應所做的病理分析。
Figure41 紊亂的天生免疫響應的病理分析
可以看到，因大量細胞產生病變效應，產生了大量單核細胞和中性細胞在肺部的炎症響應，這是一種免疫系統疾病。新冠病毒造成大量細胞死亡（Apoptosis）和焦亡（Pyroptosis），並造成ACE2受體的下調和脫落。這些的共同作用使得在發生初級炎症反應時，細胞因子和趨化因子得到釋放，抗病毒因子得到表達，造成肺部被病毒侵入，血管滲透性增加，淋巴球減少和RAS功能發生障礙。
病毒的中合抗體（Virus NAb，neutralizing antibody）激活了抗體的Fc受體，使得巨噬細胞響應發生偏移和創傷癒合反應喪失，併產生單核細胞趨化蛋白（MCP-1，Monocyte chemoattractant protein-1, ）和白細胞介素8 （IL-8）。而且中和抗體激活補體系統（complement system）和抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用（ADCC，antibody dependent cellular cytotoxicity）都會對細胞造成損傷。
天生免疫系統的紊亂性炎症反應造成的結果是出現肺炎和急性呼吸道炎症（ARDS），這和與其他類型的ARDS很相似，併產生各種細胞因子風暴（Cytokine Storm）。單核細胞和中性細胞對肺部的侵犯造成肺部表皮脫落和上皮屏障喪失，出現水腫，氧交換不足，造成嚴重的肝臟和心臟損傷。
Figure 42 急性呼吸道炎症對肺部的損傷
發生病變的肺部看上去就是這樣的。這是典型的急性呼吸道炎症（ARDS），會伴隨嚴重的細胞因子風暴，即各種炎症性的細胞因子風暴。這種損傷不僅僅針對肺部，而且還會影響肝部、心臟等其他組織的損傷。很多死於該病的病人既是死於肺炎，也是死於肌病（ myopathy ）。出現肺部上皮屏障功能喪失，氧氣交換不足，這就是為什麼病人要上呼吸機的原因。
單核細胞和中性細胞是急性呼吸道炎症造成肺部損傷的主要原因。圖43 非常經典地描繪了肺部的損傷狀態，作為對比，左邊是正常的肺部狀態，而右邊是受到損傷的肺部狀態。右半邊可見肺部充滿了中性細胞和肺巨噬細胞，肺部的喪失了活性層，嚴重積水，使得氧氣無法交換。
Figure 43 中性細胞和巨噬細胞對肺部的損傷
我想借此感謝我們學校的Aaron Diaz實驗室的專家們在這方面的工作。
再來看看新冠病人的病程情況：
Figure44 新冠病程
圖44描述了整個感染得病的過程，這是中國在疫情爆發早期做的一項重要研究。病人從感染早期出現發燒和咳嗽，一週後出現呼吸困難，10天后收入急診室並注射皮質類固醇，20天后轉陰，此後出院。對於非倖存者兩週後出現急性心臟和腎臟損傷和繼發性感染，無法清除病毒，不到20天死亡。
關於新冠疾病的治療，經常問的2個問題是：如何治療？和何時治療？
在感染早期（第一週），在病毒高度複製期，應使用抗病毒方案治療，應該採用抗病毒、阻止病毒複製並阻止病毒進入的治療方案，儘量降低病毒載量、防止急性呼吸窘迫症和降低死亡率。
在得病後期（第二週），病毒在細胞內已經釋放，當感染已經開始造成免疫系統疾病時，就應該採取調節免疫系統的治療方案，這時應考慮避免細胞因子風暴，通過調節細胞因子水平防止病人出現免疫系統疾病，並用抗炎症藥物減少炎症對肺部和心肌損傷。
這是行內的基本觀點，只是要掌握好何時採用抗病毒的方案，何時開始用免疫調節的方案。
還有一個問題是，為什麼老年人在這次的新冠流行中病情更嚴重？我對此有濃厚興趣，因為我自己也在這個風險組中。並不是說老人容易被感染，其實兒童也同樣會被感染，之所以老年人風險大還另有原因。
中國醫生今年三月份做了個研究發表在NEJM上，1391個兒童中有12.3%被感染，中位年齡為6.7歲，15.8% 無症狀，41.5% 有發燒咳嗽和咽喉紅腫症狀，但只有1%有肺炎。患重症只有一個孩子，因為他患有白血病。
其實不同年齡組被病毒感染的差異在對獼猴的研究中也有過報道。Saskia L. Smits, et al 在2010年做過一個研究發表在PLOS Pathogens上，研究了獼猴的天生免疫系統對薩斯病毒響應情況。他得出的結論是，老年靈獼猴的天生免疫系統在應對SARS病毒時會比較糟糕。他用6只年輕獼猴和6只老年獼猴做對照實驗，如下圖：
Figure46 SARS病毒對不同年齡獼猴的影響
Figure 47 獼猴SARS感染對肺部的損傷
可以看出，老獼猴的肺部損傷和病情程度都較為嚴重。作者將老年獼猴病情嚴重歸因於α干擾素響應較弱。他們在老獼猴一旦感染後立即使用重組α干擾素進行治療，馬上病情就會得到改善，變得和年輕獼猴的恢復差不多。
那麼究竟老年人的免疫系統有何不同呢？我認為可能是老年人接觸的病原多，經常受到冠狀病毒感染，體內的抗體濃度水平高，容易產生ADE反應。可能老年人的天生免疫系統比較弱，產生I-型干擾素的速度很慢。這方面有些人體實驗，也有關於免疫反應和慢性炎症相關性的研究。老年人體內的慢性炎症狀態的確很多，這些慢性炎症會改變人的天生免疫反應，對慢性炎症的適應都是後轉錄（post transcriptional)或後基因組(post genomic) 的，出現染色質（Chromatin）修飾這類現象，通過約束天生免疫反應來限制老年人對慢性炎症的反應強度。這也許就是老人或老猴子的一種適應性變化，讓天生免疫系統變得弱一些。也可能是T細胞和B細胞的變化造成的。日本做過一個研究，對100歲的老人和50歲老人進行比較，發現老年人的B細胞較少而T細胞被改變了。
Figure 超百歲老人和對照組PBMC的單細胞轉錄組分析
本圖是tSNE圖（ t-distributed stochastic neighbor embedding，t分佈隨機鄰接嵌入圖）。現在研究免疫學問題少不了要用tSNE圖分析。
用周邊血液單核細胞測試，結果是，百歲老人的B細胞較少（？？）（但抗體水平並不低）並可見有許多奇怪的CD4+ 型的細胞毒性T細胞沉積，CD4+的性質是寡克隆的。你可以想象，這時如果被冠狀病毒感染會非常麻煩。因為用以應付病毒的T細胞選擇非常有限，就會比較容易感染冠狀病毒。
可是這還是解釋不了，和其它的病毒比較，例如流感病毒，為什麼新冠病毒對不同的年齡組的影響差異那麼大。所以我們唯一的答案是：天知道呢？
未來會怎樣？我這裡來介紹一個預測工具。這是西雅圖的華盛頓大學（UW） 公共健康學院的一幫人做的，可以預測死亡人數和醫療資源的佔用和短缺情況。網址是：https://covid19.healthdata.org/united-states-of-america
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