2020年3月6日，PNAS 線上發表牛津大學Wei E. Huang 課題組的文章Chromosome-free bacterial cells are safe and programmable platforms for synthetic biology [1]，闡述了將去除染色體的細菌（chromosome-free cells 或者 Simple cells 或者
SimCells）用於微生物療法的新進展。
文章標題
合成生物學的目標是使生命體能夠精確、安全、可靠地執行我們規定的功能，而生命體的目標是活著。這種分歧導致基因線路和宿主之間存在一種天然的矛盾，使得合成線路往往由於下面幾種原因失去功能：
- 細胞體系的複雜性和多樣性
- 無法預測的基因表達
- 與內源基因網絡的串擾
- 轉座元件導致的突變
去除染色體的細胞（SimCells）處於細胞與非細胞的界限，它可以執行一定的細胞功能，但是無法複製。這種特性使得SimCells可以用於作為細菌療法的載體，它可以檢測、靶向、然後分泌藥物分子，而不會造成生物安全方面的擔憂。
SimCell的構建和檢測
如何降解細菌中的染色體，而不殺死細菌呢？用核酸內切酶。
誘導 I-CeuI 表達後DAPI染色的熒光逐漸消失，說明染色體被降解
核酸內切酶 I-CeuI 可以識別一段長達26個鹼基的序列，並且誘導DNA雙鏈的斷裂。這段序列在許多細菌編碼 23S rRNA 的保守基因 rrl 中，因此根據不同細菌基因組中23S rRNA拷貝數的不同，I-CeuI 可以在基因組的不同位置切斷DNA，從而把染色體切成幾片。由於這些雙鏈斷裂無法被同時被修復，因此染色體分子最終變得不穩定，最終被RecBCD和其他核酸酶降解。
與正常細胞相比，SimCell的能量代謝情況。藍色表示被下調的基因和通路，紅色表示上調的基因和通路。
同時，為了延長細菌在染色體被降解後的生存時間，該文章將編碼糖酵解通路的基因簇（包含10個基因，促進ATP和NADH的產生）放在質粒載體上，引入了SimCell。同時，為了使SimCell執行特定的功能，還需要一個功能質粒，編碼它需要執行的任務。因此，整個系統包含三個模塊：降解模塊，能源模塊和功能模塊。
SimCell的遺傳組成。第一個模塊是降解模塊；第二個模塊是糖酵解；第三個是功能模塊
怎麼樣確定染色體是不是被降解了呢？有兩種辦法：一種是檢測細菌的分裂能力，因為染色體被降解後無法分裂；一種是將gfp基因插入細菌基因組，通過檢測熒光確定染色體是否降解。
綠色熒光：基因組；紅色熒光：外源質粒。糖酵解通路的表達有助於外源功能基因的表達
綠色熒光：基因組；紅色熒光：外源質粒。可以看出表達I-CeuI的菌液是SimCell與正常細胞的混合液；而糖酵解通路的表達有助於外源功能基因的表達
通過檢測分裂能力，可以看到雖然表達 I-CeuI 的菌液形成的菌落數要被比不表達 I-CeuI 的菌液小2個數量級，但仍然有部分細胞可以分裂；通過檢測熒光，可以看出表達I-CeuI的菌液是SimCell與正常細胞的混合體。因此，如何將SimCell與正常細胞分開，即如何從培養液中純化出SimCell來，是下一個需要考慮的問題。
添加環絲氨酸後，活躍分裂的細胞比例大幅降低，其中表達I-CeuI的菌液中沒有可以繼續分裂的細胞
研究者們採用環絲氨酸（D-cycloserine），一種抑制細胞壁合成的抗生素，去殺死培養基中具有活躍分裂能力的細胞，從而達到了純化SimCell的效果。從表中可以看到向培養基中添加環絲氨酸後，表達I-CeuI的菌液中沒有可以繼續分裂的細胞了（CFU為0）。
那麼SimCell可以存活、並行使功能多長時間呢？
表達不穩定的mRFP產生的熒光在10天后停止增加
在本底表達糖酵解基因簇的情況下，SimCell可以保持活躍的轉錄翻譯功能長達10天；而誘導糖酵解基因簇的情況下，由於大量的轉錄和翻譯資源被糖酵解迴路佔用，SimCell可以正常表達的時間反而有所下降（約5天）。
儲藏溫度和可以正常功能的細胞比例。4℃存儲的功能細胞比例略高於-80℃存儲。
而由圖我們可以看到，在儲藏在4℃和-80℃的情況下，經過1天，還有30%左右的SimCell可以正常功能，但儲藏時間超過1周後，只有低於5%的SimCell可以正常功能。因此，如何儲藏SimCell仍然是一個問題。
SimCell用作微生物療法的底盤
研究者選擇了兒茶酚（Catechol；1,2-dihydroxybenzene）的生產來做SimCell在細菌療法方面的展示。自然界中的兒茶酚存在於水果和蔬菜中，能夠誘導肺部和腦部癌細胞的凋亡，而不會影響正常細胞。
為了實現較高的兒茶酚產量，研究者採用了正反饋迴路的設計。在沒有水楊酸時，SalR會抑制啟動子Psal；而在存在水楊酸時，SalR的構向改變，對Psal的抑制解除，促進SalA和SalR的表達。同時SalA又能以水楊酸為底物合成兒茶酚。
由圖C可以看出，兒茶酚確實對腫瘤細胞（A549, Mo59K, RD）有殺傷作用。由圖B和D可以看到，表達上述基因的SimCell可以合成兒茶酚，並且造成了一些腫瘤細胞的死亡。
然而這種致死效應確實不能說的上好，即使在體外實驗中也仍有大於70%的腫瘤細胞存活，這或許也是沒有進一步做小鼠實驗的原因。討論
從這篇文章看，目前SimCell的研究還有一些問題：
- SimCell的功能時間和儲存條件。如果無法達到長時間存儲的話，不管應用到哪個領域都比較難，除非每次都現用現製備。
- SimCell的轉錄和翻譯資源。糖酵解通路在產生ATP和NADH的同時，也佔用了相當一部分轉錄和翻譯資源，這樣功能模塊的表達有可能得不到保證。
- 就本篇文章來說，選擇兒茶酚的合成可能是無奈之舉，因為基因迴路足夠簡單，能夠避免轉錄和翻譯資源的過分佔用，一定程度上保證產量。同時兒茶酚的合成避免了抗體類蛋白合成帶來的細胞裂解問題, 因為如果採用細胞裂解方式釋放藥物，SimCell相對正常細胞的安全優勢就沒有辦法體現了。
- SimCell不能複製，這避免了生物安全問題，但也丟掉了細菌複製帶來的優勢。比如雖然SimCell可能在癌組織處富集，但局部濃度肯定會低於正常細菌，因此療效可能會打折扣。
用於檢測的細菌膠囊。圖源：科學美國人
因此目前來看，相比於治療，或許SimCell更適用於檢測。通過口服，使其通過腸道，檢測其中某種疾病信號，結合記憶模塊，然後輸出信號。
附圖來自[2]。
另一種用於檢測的細菌膠囊。能夠將信號通過無線信號傳輸到設備中 [2]
參考
- ^https://www.pnas.org/content/early/2020/03/02/1918859117
- ^Mimee M , Nadeau P , Hayward A , et al. An ingestible bacterial-electronic system to monitor gastrointestinal health[J]. Science, 2018, 360(6391):915-918.
閱讀更多 元元依依的小溪 的文章
