RDP Trio™試劑
英文：RDP Trio™Reagent
品牌：HiMedia
貨號：MB566
規格：100ml
用途：【DNA】、【RNA】和【蛋白】的快速分離
簡介
RDP Trio™試劑用於從人、動物和植物樣品中方便快捷地分離RNA、DNA和蛋白。獲得的RNA可用於下游的Northern 雜交、mRNA分離、體外翻譯、RT-PCR等。RNA長度從0.1~15kb，DNA可用於PCR、酶切、Southern雜交，蛋白可用於Western Blotting。
原理
RDP Trio™試劑為硫氰酸胍和苯酚的單相混合液，能有效溶解RNA。加入氯仿並離心後，溶液分為3相，水相含RNA，中間相含DNA，有機相含蛋白質。1ml RDP Trio™試劑可用於50-100 mg組織、5-10×10 6細胞、或 10 cm2平皿單細胞層。該方法對Chomczynski和Sacchi發明的RNA一步分離法進行了改進，可在1小時內完成。
操作流程
1) 樣本製備
1a. 組織：採用勻漿器將樣品和RDP Tri™o試劑試劑充分混勻， 1ml RDP Trio™試劑適合50-100mg組織
1b. 單細胞層: 在平皿中直接裂解細胞，10 cm2平皿單細胞層加1mlRDP Trio™試劑，用移液器吹打。平皿要求為玻璃皿，不能為塑料皿。
1c. 懸浮細胞：最多離心1×107細胞，4℃，300 × g，5min。棄上清，加1ml RDP Trio™試劑，反覆吹打。（動物細胞、細菌、酵母、植物細胞數量均同上）
注意：
1. 細胞用RDP Trio™試劑勻漿或裂解後，在-70℃可放1個月時間。
2. 如果下列成分含量較高，可能需要額外的操作步驟，具體參考原版說明書：脂肪、蛋白、多糖和細胞外基質（如肌肉）。
2）相分離
將均質化的樣品在室溫（15-25℃）孵育5分鐘，使核蛋白複合物完全解離。
每毫升RDP Trio™試劑加入200μl氯仿。蓋緊樣品，劇烈搖動15秒，在室溫（15-25℃）下靜置10分鐘。將得到的混合液以12,000×g（≈13,000rpm）在4°C時離心15分鐘。離心後，混合液分成底部深紅色有機相（含蛋白質），中間相（含DNA）和無色含有RNA的上層水相。（以下繼續下面相應的RNA/DNA/蛋白分離步驟）
注意：用於相分離的氯仿不應含有異戊醇和其他添加劑。
RNA分離步驟
1） RNA沉澱
將含有RNA的水相轉移到新管中並加入500μl異丙醇。 讓樣品在室溫（15-25℃）下靜置5-10分鐘。 在4℃下以12,000×g（≈13,000rpm）離心10分鐘。通常在離心前不可見的RNA沉澱，在管底或側面形成膠質狀沉澱。
提示：2-8℃保存中間相（含DNA）和有機相（含蛋白質）。
2）RNA清洗
去除上清液而勿碰到沉澱。加入1ml75％乙醇清洗RNA沉澱。渦旋樣品，然後在4℃下以 750×g（≈10,500rpm）離心5分鐘。
3）RNA復溶
去除上清液而勿碰到沉澱。風乾RNA沉澱5-10min。不要讓RNA完全乾燥。加50µl無RNA酶水溶解RNA。為方便溶解，可用移液器反覆吹打。在55-60°C孵育10-15分鐘。提取的RNA可在-80°C保存。避免反覆凍融。
DNA分離步驟
1）DNA沉澱
去除中間相上面的水相。轉移包含DNA的中間相至新管中。每mlRDP Trio™試劑中加入300μl無水乙醇。混勻，室溫靜置3min。4℃離心12000 ×g（≈13000rpm）5分鐘。
2）DNA清洗
取上清，勿碰沉澱。上清2-8℃保存用於蛋白提取。用1 ml 含0.1M檸檬酸三鈉和10%乙醇的溶液清洗DNA沉澱。DNA沉澱室溫下靜置30分鐘。7500×g (≈10,500 rpm)4°C離心5分鐘。棄上清，重複清洗1次。
棄上清，用1.5ml75%乙醇溶解DNA沉澱。再室溫靜置10~20分鐘，再7500×g (≈10,500 rpm) 4°C離心5分鐘。
提示：乙醇中的樣本可在2-8°C保存幾個月。
3）DNA復溶
棄上清，勿碰沉澱。風乾DNA沉澱5~10分鐘。加DNA沉澱中加100l洗脫緩衝液(10mM Tris-Cl, pH 8.5，貨號DS0040) ，7500×g (≈10,500 rpm)4°C離心10分鐘，以去掉不溶物。轉移上清至新管中。純化的DNA即為基因組DNA，2-8°C可保存1-2天。-20°C或-80°C可長期保存。避免反覆凍融，因其可能造成DNA變性。洗脫液有助於穩定DNA。
蛋白分離步驟
1) 蛋白質沉澱
從純化DNA第2步分離到的上清液中沉澱蛋白質。每ml RDP Trio™ 試劑加入1.5ml異丙醇。讓樣品在室溫 （15-25℃）下靜置10分鐘。再在4℃下離心12,000xg（13,000rpm）10分鐘。
2）蛋白質清洗
棄掉上清液而勿碰沉澱。加入2ml 0.3M鹽酸胍、95％乙醇溶液洗滌沉澱。讓沉澱在室溫（15-25℃）靜置20分鐘。在4℃離心7,500 x g（10,500rpm）5分鐘。棄去上清液並重復該洗滌步驟兩次。棄去上清液，加2ml 96-100％乙醇，渦旋以溶解蛋白質沉澱。讓樣品在室溫下（15-25℃）靜置20分鐘。再4°C下 以 7,500 x g（10,500rpm）離心5分鐘。
3）蛋白質復溶
棄掉上清液而勿碰沉澱。將蛋白質沉澱短暫風乾5-10分鐘。向蛋白質沉澱添加適量的1％SDS。以7,500 x g（≈10,500rpm）4°C離心10分鐘，以去除任何不溶物質。將上清液轉移到新管中。
提取的蛋白質溶液可立即用於Western蛋白印跡或儲存在-20℃。
存儲條件及效期
15--25°C，效期1年
參考文獻
1. Chomczynski P., BioTechniques 15,532-537(1993).
2. Chomczynski P. and Sacchi,N., Anal .Biochem.,162,156-159(1987).
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