本週二，實驗與分析平臺特別邀請了南京海關動植物與食品檢測中心 液相液質檢測組組長張健老師與小夥伴分享了高效液相色譜方法開發、常見故障與維護（課程鏈接：http://zhibo.vogel.com.cn/watch/5201868），得到小夥伴們的熱烈歡迎，強烈小析姐把課程內容整理成文章分享給大家，所以小析姐把當天的內容內容以及小夥伴們的問題進行了彙編，分享給大家，希望對你的工作學習有所幫助。
HPLC是一種區別於經典液相色譜，基於儀器方法的高效能分離手段。廣泛應用於各個領域：醫藥，環保，石化，生命科學，食品，農業等領域，無論在技術上，理論上，還是在應用上仍有較大的發展空間: 超高壓液相色譜(UPLC)的創立
HPLC原理
溶於流動相(mobile phase)中的各組分經過固定相時，由於與固定相(stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先後從固定相中流出。
HPLC的分類
HPLC的組成
主要組成部分如下：
⚫ 輸液系統
⚫ 進樣系統
⚫ 分離系統
⚫ 檢測系統
⚫ 數據處理系統
1、輸液泵
（1）四元泵
⚫ 流動相選擇更為靈活
⚫ 結構簡單，故障率低
⚫ 對脫氣要求高
⚫ 不易調節梯度的滯後體積
（2）二元泵
⚫ 低流速下（<0.2mL/min），有更好的流量精度和混合精度
⚫ 可以不使用脫氣機
⚫ 溶劑切換不靈活
泵系統為輸液系統中最為核心部分，也是整個液相色譜系統中最為核心的部分
2、脫氣機
原理：溶劑瓶中的溶劑在 LC 泵的抽取下流過真空箱內的特殊管狀塑料膜。當溶劑經過真空管時，溶劑中溶解的氣體將滲過塑料膜進入真空箱。當溶劑離開真空脫氣機的出口時，幾乎已被完全脫氣。
輸液泵-洗脫模式
（1）等度洗脫
等度洗脫：用恆定配比的溶劑系統的洗脫方式
優點：簡便、重複性好。
缺點：對於成分複雜的樣品，效果不佳。
（2）梯度洗脫
3、進樣系統
進樣方式分為自動進樣系統（是否帶溫控）和手動進樣
系統核心部件：六通閥
取樣時，流動相直接進柱，進樣口與定量管連接，樣品充滿定量管後，多餘樣品從6流出。
進樣時，泵將流動相壓入定量管，將樣品全部進入色譜柱分析。
帶有清洗模式的六通閥進樣系統，清洗包括：注射器、定量環和進樣針外壁。
進樣系統還包括樣品盤室控溫功能避免樣品快速揮發。
4、分離系統
液相色譜柱是整個HPLC系統的分離核心。
化學鍵合相色譜柱：70%將不同的官能團通過化學反應鍵和到硅膠表面的遊離羥基上，而形成化學鍵和固定相，進而形成化學鍵和相色譜柱。反相：C18, 65%; C8, 15%; 反相色譜是目前應用得最為廣泛的高效液相色譜方法。正相：20%;-NH2、 -CN其它 (手性柱， 離子交換柱)：10%
聚合物基質柱（ eg.聚苯乙烯柱）單獨的聚苯乙烯類填料柱主要用於分離蛋白質類等大分子化合物，多用於GPC、GFC、MEC等；若與離子交換基團共鍵則形成離子交換柱，用於分離酸性化合物（磺酸基團）、鹼性合物（季銨基團）及藥物代謝產物等。
特點：
⚫ 在1＜PH＜13的流動相中穩定；
⚫ 分離峰形較好，柱子壽命較長。
其他無機物填料柱如氧化鋁、石墨化碳、氧化鋯、硅藻土等，主要作製備色譜用。
柱溫箱
⚫ 控制溫度，保證分析結果重現性；
⚫ 升高溫度，降低了流動相的黏度，降低柱壓，保證色譜系統的穩定性
某些情況，提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）
5、檢測器
檢測器分類：
藥典中，紫外檢測器（VWD）佔比74%；二極管陣列檢測器（DAD）佔比23%；蒸發光散射(ELSD)佔比3%
（1）檢測器-紫外
原理：用特定波長的紫外光照射樣品池，通過檢測透光率的變化來測定樣品濃度的檢測器。它具有波長固定，波長可變和光二極管陣列三種類型。
定量基礎：Lambert-Beer定律，A＝Kbc
優點：
➢ 選擇性檢測選擇性檢測器、波長檢測範圍：190-800nm ；
➢ 對流量和溫度敏感性低、靈敏度較高；
➢ 應用最廣，對大部分有機化合物有響應；
➢ 對流動相的流速和溫度變化不敏感；
➢ 波長可選，易於操作；
➢ 可用於梯度洗脫。
缺點：
➢ 由於不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測器；
➢ 受流動相組成的影響。
用截止波長以上至少5～10nm作為工作波長，緩衝鹽、離子對試劑、胺改性劑也會有影響
✓ 背景吸收降低了線性範圍
✓ 多數流動相有紫外吸收
（2）檢測器-二極管陣列（DAD）
光電二極管取代了傳統的光電倍增管，在一次色譜操作中可同時獲得多波長的吸光度，並且可以採用現代微機技術將各組份的保留時間、吸收波長和吸光度匯合一起，繪製三維譜圖，提供既定量又定性的色譜信息。
光譜信息的作用：
➢ 提供定性依據
➢ 純度鑑定
（3）檢測器-熒光（FLD）
發熒光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子達到激發態，其返回到基態時發射光的現象即熒光，共軛及芳香族化合物最容易有熒光現象。
原理：某些溶質在紫外光激發後能發射可見光（熒光）的性質檢測。
優點：
➢ 選擇性好、靈敏度高（10-12g）、對流量和溫度敏感性低。
缺點：
➢ 不是所有化合物都有熒光，需要衍生;
➢ 檢測器對溶解氣體及其他淬滅物質（如甲醇）敏感;
➢ 對Ex及Em的最佳波長，易受溫度、溶劑的極性和粘度、溶劑的pH值及樣品濃度影響。
（4）檢測器-示差（RID）
原理：監測參比池和測量池中溶液的折射率之差來測量試樣濃度的檢測器。
優點：
➢ 通用檢測器
➢ 容易使用；
➢通常來說是比較耐用的檢測器；
➢ 維護成本低
缺點：
➢ 靈敏度低、選擇性差；
➢ 對流速、溫度及粘度的變化敏感；
➢ 不能用於梯度方法；
➢ 色譜峰可能是正的，也可能是負的。
典型的應用領域沒有紫外吸收、熒光的化合物，例如：碳水化合物、聚合物、脂肪酸及油脂類。
a.溫度對於RID的影響
b.流動相梯度對於RID的影響
RID溫度變化要保持在±0.001℃，且不能用於梯度檢測
（5）檢測器-蒸發光散射（ELSD）
原理：通過檢測光散射程度而測定溶質濃度的檢測器。色譜柱後流出物在通向檢測器途中，被高速載氣（氮氣）噴成霧狀液滴，再進入蒸發漂移管中，流動相不斷蒸發，含溶質的霧狀液滴形成不揮發的微小顆粒，被載氣載帶通過檢測器。
優點：
➢ 可以作梯度實驗；
➢檢測下限可到納克級水平；
➢ 對環境條件不敏感；
➢ 可以使用有強紫外吸收的溶劑作流動相。
缺點：
➢ 不能使用不揮發性的流動相（例如：磷酸鹽）；
➢ 破壞性技術；
➢ 對揮發性化合物的檢測不理想；
➢ 一般得到的是非線性校正曲線；
➢ 某些化合物的檢測靈敏度不如其他檢測器。
應用領域：碳水化合物、油脂及脂肪酸、未衍生的氨基酸製藥行業、表面活性劑、天然產物
建立HPLC方法的基本步驟
1、分離條件的的建立及優化
（1）樣品前處理
⚫ 最好使用流動相溶解樣品。
⚫ 使用預處理除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。
⚫ 使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。
要考慮的因素：
⚫ 要分離的化合物/樣品的化學特性；
⚫ 化學結構、分子量及紫外光譜等等；
⚫ 流動相的影響（溶劑、緩衝鹽改性劑等）；
⚫ 梯度還是等度；
⚫ 靈敏度需求；
要考慮的因素：
⚫ 流動相的選擇；
⚫ 色譜柱的選擇；
⚫ 流速、洗脫模式；
⚫ 方法微調和優化；
流動相
性質要求：一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易於得到純品和低毒性等特徵。
pH：對於應用廣泛的反相色譜，通過調節流動相的pH值，抑制樣品組分的解離，能增加組分在固定相上的保留，並改善峰形。
2、流動相
對於弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小於弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在;對弱鹼，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和1%醋酸溶液;分析弱鹼樣品時，通常在流動相中加入少量弱鹼，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和30mmol/L三乙胺溶液。
緩衝鹽有助於增加方法的可靠性，促進色譜峰的尖銳性常用緩衝鹽包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽
3、校正定量方法
HPLC常見故障與原因分析
HPLC的日常維護
1、流動相
⚫ 水相和緩衝鹽應儲存在棕色玻璃瓶，以避免藻類的生長；
⚫ 流動相應經過0.45um或更小孔徑的濾器過濾；
⚫ 水相和緩衝鹽應及時更換，一般使用不超過兩天；
⚫ 定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶，每三個月至少清洗一次。
⚫ 玻璃溶劑過濾器（不能超聲）可以放在35%硝酸溶液中浸泡；
⚫ 金屬過濾器不能用酸浸泡，可以放置在甲醇溶液中超聲清洗。
2、泵組件
3、柱塞清洗系統（seal wash）
⚫ HPLC使用緩衝溶液Buffer時，由於緩衝鹽溶液存在高壓鹽析現象，析出的細小鹽粒會損傷藍寶石柱塞杆和密封墊，從而造成漏液等故障現象，因而建議選配柱塞清洗附件Seal Wash。
⚫ 緩衝鹽濃度大於0.01mol時，強烈建議選配在線的柱塞清洗附件Seal Wash。
⚫ 清洗液配置：90%水+10%異丙醇溶液，流速為2-3滴/min。該混合液可抑制菌類生長和降低水的表面張力。清洗液虹吸流出，不能幹涸。
儀器配備了柱塞清洗系統，如果日常使用並不涉及緩衝鹽，也須始終保持seal wash 管路充滿液體，否則會增加柱杆活塞運動的阻力，損壞柱塞密封組件和柱塞杆。
4、檢測器
（1）UV檢測器
如果流動池被汙染可先用以下方法處理：在不連接色譜柱的情況下先用高純水沖洗20分鐘，然後用5％硝酸沖洗2小時，最後再用高純水沖洗至流出液中性即可。
⚫ 述方法不果，就需更換流動池的檢測窗。
⚫ 上述處理方法也適用於DAD的流動池。
（2）熒光檢測器
由於水性流動相長時間留在流動池會有藻類生長，而藻類會產生熒光，所以可添加有機溶劑如5％的乙腈或甲醇。
如懷疑流動池被汙染可用以下步驟清洗之：
a. 用雙蒸水沖洗30分鐘以上；
b. 用注射器注射65％硝酸入流動池並使其留在流動池約1小時；
c. 用雙蒸水沖洗乾淨。
檢測器中有硝酸時，不要使用泵或者HPLC其他組件，否則硝酸會腐蝕HPLC系統組件，同時在沖洗過程中不要超出20bar
5、色譜柱
進行色譜柱再生時，應使用一個廉價的泵，最好不使用高效液相色譜儀上的泵。
色譜柱再生方法：
極性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色譜填料）的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水** 。
非極性固定相（如反相色譜填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或異丙醇）→乙腈→水0.05M稀硫酸可以用來清洗已汙染的色譜柱。
注意：
在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由於NH2可能成銨根離子的形式存在，因此應該在水洗後用0.1M的氨水沖洗，然後再用水沖洗至鹼溶液完全流出。
**如果簡單的有機溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質，用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
⚫ 過濾所有的溶劑和樣品；
⚫ 使用保護柱；
⚫ 儀器在使用完畢，要衝洗整個系統，移走系統中的緩衝液。
⚫ 柱子在不使用時，兩端密封保存；
⚫ 在適當的溶劑中保存柱子；
⚫ 注意色譜柱的pH值使用範圍；
⚫ 不要高壓沖洗柱子。
6、其他
◆ 正相色譜、反相色譜切換時應使用IPA過渡，長期使用正相，應更換正相柱塞密封墊；
⚫ 樣品進樣之前最好過濾，如果樣品量太少，可以適當抬高進樣針的位置；
⚫ 注意不同檢測器流通池耐壓問題，儘量避免使用pH>9.5的流動相，以防腐蝕流通池石英窗，避免使用可能析晶的流動相，防止流通池堵塞；
⚫ 不同檢測器最大耐壓：VWD 40bar 、 DAD 60bar、 FLD 20bar 、 RID 5barRID永遠是最後一個檢測器。
網友問題精選
1、色譜柱幹了還能用嗎？
答：色譜柱幹了可以通過再生繼續使用的，利用全有機相，例如，甲醇、乙腈等溶液，低流速排除柱子內的氣泡，在這裡不建議使用純水沖洗，純水的排氣效果遠遠比不上有機相的效果。
2、四元泵和二元泵有什麼區別呢？
答：四元泵有一組泵和一個比例閥，通過控制比例閥控可以制四個通道，調節四個通道的溶液比例。二元泵有兩組泵，每組泵控制一個通道，因此只能控住兩個通道。
3、玻璃過濾頭25％硝酸浸泡，是否需要過夜？
答：當使用35%的硝酸浸泡時，只要1個小時就可以達到目的效果，當使用20%的硝酸時，過夜的效果會更好一些。
4、正相柱塞杆可以用於反相色譜嗎？
4、答：當使用反相色譜要切到正相時，正相為叔丁基甲醚、四氫呋喃等極性比較小的流動相時會對反相色譜的柱塞密封圈產生腐蝕作用，如果經常使用諸如此類流動相時，還是要把反相色譜的密封墊進行更換。
5、安捷倫1260-II的儀器經常出現自動進樣器針座壓力高，是怎麼回事？
答：如果流動相是過濾使用的，進樣器針座經常壓力高，意味著樣品裡有未溶解的雜質，可以通過重新選取濾膜進行解決。冷藏或者靜置也會起到一定的沉澱作用。
6、峰形不好的原因有哪些？
答：液相峰形不好的原因有很多，首先，最好選用流動相溶解樣品，避免溶劑效應；其次，有可能是流動相的PH值不當，建議使用緩衝鹽；此外，進樣量、色譜柱老化也會影響峰形。
7、老師，色譜柱堵了，一般如何解決
答：色譜柱堵塞絕大部分會發生在柱頭，有條件的情況下，可以將柱頭篩板拆卸下來，進行超聲清洗，或者將色譜柱進行短時間反接沖洗。
8、如果檢測物質的標樣是用甲醇定容，而樣品是用水前處理，標樣與樣品上機檢測，是不是峰型與保留時間會有差距？
答：有可能會產生溶劑效應，溶劑效應最明顯的特徵就是峰前延，所以對峰形會有影響，對保留時間影響不大，如果檢測物質的響應足夠高，可以通過減少進樣量，降低溶劑效應，進而改善峰形。
9、分析柱和保護柱的區別，保護柱怎麼用？
答：保護柱的主要作用是將流動相中的顆粒雜質留在保護柱內，對於高酸、高鹼的流動相，有填料的保護柱也可以保護色譜柱填料。相比於分析柱，價格會便宜很多。
10、流動相如果跑空了，會有什麼後果呢？怎麼解決呢？
答：在整個色譜系統中都會氣泡進入，解決辦法就是排氣泡，進行系統沖洗。
11、飼料產品中不進行前處理提取，直接用甲醇定容，可以嗎？
答：飼料基質會含有許多成分，例如，高蛋白，如果直接用甲醇定容，效果不是很好，不過還是要由分析的物質決定。
12、二元泵柱塞杆串聯和並聯有什麼區別，哪種更好？
答：二元泵柱塞杆串聯有串聯模式，但現在實驗室裡大部分二元泵都是並聯模式的。
13、老師，泵壓會隨氣溫變化影響嗎？
答：我們知道溫度越高，流動相的粘度就會越低，因此，系統壓力會相應的減小。
14、用硝酸清洗流通池的時候，怎麼能不經過泵啊？怎麼操作的啊？
答：可以利用注射器吸取35%的硝酸溶液，將硝酸溶液直接打進流動池。
15、手動進樣，定量環20微升 怎麼進5微升？
答：無論是手動進樣還是自動進樣，定量環只有兩種進樣方式：滿環進樣和半環進樣。所以，可以進20微升，也可以進10微升，甚至更少。
16、安捷倫液相1290的進樣量最大是多少？
答：安捷倫1290在不增加定量環的情況下，通常是20微升。
17、老師，請問流動性ph用醋酸調2.85這個要怎麼操作？
答：可以利用pH計進行調節，在調節過程中，流動相中最好不要有甲醇、乙腈等有機相，否則會對pH調節造成影響。
18、反接沖洗之後是不是隻能反著用了？
答：不是的，反接沖洗的目的只是疏通堵塞的柱頭，洗出汙染之後，只要壓力正常，也可以正著使用。
19、含量測定要求進5微升，實際進20微升，會影響含量測定結果嗎？
答：含量測定是與標樣進行對比的，如果標樣也是進了20微升，對測定結果是沒什麼影響的。
20、正相色譜柱的保存方法？
答：正相色譜柱與反向色譜柱一樣，都會保存在有機相里。
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