撰文 | 赤貞
人體皮膚由分層的鱗狀上皮構成，其最表層是無核、扁平的皮膚鱗片，用以抵抗外界的極端環境。皮膚鱗狀上皮具有較強的自我更新能力，其基底層祖細胞在向上遷移的過程中逐步分化、丟失胞核並最終形成死細胞層。在形態學上，這一過程伴隨著不分裂角質形成細胞胞漿內角質透明蛋白顆粒（KG）的形成、解聚和消失。
2020年3月13日，洛克菲勒大學Elaine Fuchs團隊在Science上發表長文Liquid-liquid phase separation drives skin barrier formation，證實角質透明蛋白顆粒的形成是由絲聚蛋白“液-液相分離”驅動的，該相分離的動力學調控著角質細胞的終末分化，並承擔著感知外界環境變化的任務。
Elaine Fuchs院士團隊在2015年曾通過蛋白組學技術手段，發現角質透明蛋白顆粒（KG）的主要成分之一——絲聚蛋白（filaggrin, FLG）含有內源性無序區，具備發生相分離的能力，而其截短突變體則是導致皮膚屏障障礙類疾病最常見的病因之一。因此，在本研究中，研究者通過熒光傳感器，對絲聚蛋白及其突變體在小鼠體內及體外條件下發生相分離的能力和動態變化進行了探究。
首先，作者發現，絲聚蛋白及其旁系同源蛋白擁有更多的精氨酸（arginine bias=R/(R+K)），這使得他們擁有更多的與芳香族氨基酸互作的位點；其次，該家族蛋白中比例最高的芳香族氨基酸是組氨酸——既往研究顯示，富含組氨酸的內在無序蛋白必須很大才能顯現出相分離行為，而絲聚蛋白家族是人類蛋白質組中最大的蛋白之一（435kDa至504kDa）；此外，人絲聚蛋白擁有12段重複序列，具有早期截短突變體（重複序列較少）的患者不能夠形成角質透明蛋白顆粒。
研究者首先在永生化的人角質形成細胞HaCAT細胞系中對絲聚蛋白截短突變體的相分離能力進行了觀察：截短體重複序列數目大於等於4時，能夠自發地形成類似於KG的foci結構（胞內絲聚蛋白濃度約為2uM）；重複序列小於4時，則需要濃度在130-1500uM以上才能夠形成。所有截短體形成的foci在激光漂白後均能夠快速恢復，在活細胞成像中均可發生顆粒重排和融合事件，在原子力顯微鏡探針的壓力下能夠變形、在胞核周圍形成類似液體的流。表明由絲聚蛋白驅動形成的角質透明顆粒為液體樣行為，符合“液-液相分離”的特點。此外，截短體形成的foci在激光漂白後恢復時間短於全長蛋白所形成的foci，N-端截短體所形成的foci粘度顯著低於全長蛋白所形成的foci。
接下來，研究者設計了融合熒光蛋白的可溶的內源無序客戶蛋白（client），以實現在不干擾正常發育的情況下檢測內生性相分離現象的目的。該客戶蛋白自身不能夠發生相分離行為，但能夠通過與支架蛋白進行超弱的、特定於相分離的相互作用，準確定位內生性相分離的位置。研究者將該客戶蛋白穩定轉染到胚胎期9.5天小鼠的皮膚上皮內，通過整合素（Ivl）啟動子控制該熒光傳感器僅在上皮細胞分化過程中表達。
矢狀共聚焦視圖顯示，熒光傳感器信號僅侷限於表達絲聚蛋白的顆粒層，而平面視圖則顯示這些細胞中有大量被熒光傳感器標記的角質透明顆粒。活細胞成像顯示，角質透明顆粒在細胞由基底層向顆粒層遷移的過程中逐漸形成、變大，且顆粒間有融合現象，表明其具有液滴性質。然而，大部分角質透明顆粒並非通過顆粒間的融合來長大，其液滴性質與HaCAT細胞系內外源性絲聚蛋白形成的顆粒有較大的差異。當角質形成細胞由基底層向顆粒層遷移時，大部分角質透明顆粒會發生形態學變化、粘度逐漸增加、激光漂白後的恢復時間也逐漸變長，提示遷移過程中可能有其他機制影響著絲聚蛋白的相分離。
顆粒層細胞一大特點是具有豐富的末端分化特異性角蛋白1和10（K1/K10）細絲網絡，故此，研究者對K1/K10是否會參與到絲聚蛋白的相分離中進行了探索。實驗結果顯示，在顆粒層細胞中，角蛋白束完全包裹住了絲聚蛋白-角質透明顆粒，被包裹的角質透明顆粒顯示出長期的惰性的活動能力；當角蛋白束不存在時，這些顆粒顯示出較強的顆粒融合、變形等活動能力。終末分化特異性角蛋白的低複雜度結構域與角質透明顆粒間通過密度依賴的弱相互作用，形成穩定的液滴裝角質透明顆粒和角蛋白絲束的精細交織網絡。
這一交織網絡具有重要的生理意義：隨著角質形成細胞由顆粒層逐漸向上遷移，角蛋白束穩定的角質形成顆粒逐漸變得愈發擁擠，這使得細胞核和其他細胞器變形，從而導致這些細胞器在顆粒層向角質層過渡的過程中被破壞掉，最終形成死細胞角質層。
胞核丟失、細胞鱗屑化的過程十分迅速，發生於2個小時以內，首先表現為染色質壓縮，而後伴隨著染色質丟失、胞核破壞、細胞器丟失。角質形成顆粒也在這一過程中逐漸溶解。研究者們對起始這一過程的因素進行探究，發現絲聚蛋白由於富含組氨酸，酸解離常數約為6.1，當角質形成細胞從顆粒層（pH=7.4）向角質層（pH=5.5）遷移時，酸鹼環境的變化使得角質形成顆粒迅速解聚、溶解，這一過程釋放的新的蛋白可能引發了染色質壓縮（knock-out實驗表明，後者是絲聚蛋白依賴的）。
至此，Elaine Fuchs院士團隊完整勾勒出了絲聚蛋白在角質形成細胞中發生相分離、通過相分離動態調控細胞狀態、驅動細胞分化遷移、最終形成角質層鱗屑細胞的生理過程 。此外，還提供了一種研究內原性相分離的思路：通過整合本研究中的體內相分離傳感器與為近距離蛋白質組學進化而來的酶，在不干擾內源支架蛋白的情況下，對類器官、組織和生物體內的內源性“液-液相分離”進行分子和生物物理研究。
最近疫情形勢之嚴峻、COVID-2019的研究之火熱，使得CNS的寵兒相分離研究略顯遜色。Elaine Fuchs院士團隊的研究為我們揭示了相分離重要的生理、病理意義，其形成與否更是直接關係到皮膚屏障障礙類疾病的發生發展。相分離研究已不僅僅停留在理論層面、實驗室中、模式生物上，更是在向臨床、病理邁進。能夠應用到臨床的研究才是好研究，相分離領域還有許多可待挖掘之處，有待後人發現。
附圖一：被角蛋白絲束（K10，紫紅色）包裹著的絲聚蛋白-角質形成顆粒（FLG，綠色）
附圖二：角質形成細胞由顆粒層向角質層遷移過程中細胞形態變化(綠色:絲聚蛋白-角質形成顆粒;紫紅色:染色質)
原文鏈接：
https://science.sciencemag.org/content/367/6483/eaax9554
製版人：珂
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