黏液相關的固氮微生物群支持的一種玉米的固氮作用

Nitrogen fixation in a landrace of maize is supported by a mucilage-associated diazotrophic microbiota

PLOS BIOLOGY[IF:8.386]

DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006352

發表日期：2018-08-07

第一作者：Allen Van Deynze¹,Pablo Zamora¹,Pierre-Marc Delaux²,Cristobal Heitmann¹

通訊作者：Alan B. Bennett([email protected])¹

合作作者：Dhileepkumar Jayaraman,Shanmugam Rajasekar,Danielle Graham,Junko Maeda,Donald Gibson, Kevin D. Schwartz,Alison M. Berry,Srijak Bhatnagar,Guillaume Jospin,Aaron Darling,Richard Jeannotte,Javier Lopez,Bart C. Weimer,Jonathan A. Eisen,Howard-Yana Shapiro,Jean-Michel Ane

主要單位：

¹

²美國威斯康辛大學麥迪遜分校農學系(Department of Agronomy, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin, United States of America)

寫在前面

分享標題：玉米氣生根分泌物支持的高效生物固氮

關鍵字：玉米氣生根、粘液、固氮微生物、¹⁵N自然丰度法、宏基因組測序

點評：對於豆科植物來說，與固氮微生物的互利共生有助於其氮素營養的利用，但這些微生物在穀物中的作用卻十分有限，包括玉米。如何顯著提高生物固氮對非豆科植物的氮營養貢獻一直是科學的前沿熱點。加州大學戴維斯分校的傑出教授Alan Bennett課題組牽頭撰文報道了一種固氮玉米，其擁有數量眾多且分泌大量粘液的氣生根。粘液具有低氧和富含糖的特性，該分泌物富集了大量固氮菌，表現出很強的固氮活性。經多種方法計算，該品種大氣固氮對其氮素的貢獻率達到29%-82%。在未來，確定這一性狀的遺傳基礎、有關微生物固氮菌的識別和微生物的招募機制將是非常重要的。本研究和其他已發表的研究為研究玉米生物N

摘要

植物與複雜的微生物群息息相關，其有助於營養獲取、植物生長和植物防禦。固氮微生物群在豆科植物中是高效的，並且具有很好的特性，但在包括玉米在內的穀類植物中的作用是有限的。我們研究了生長在墨西哥瓦哈卡的Sierra Mixe地區氮缺乏土壤中的土著玉米品種。這種陸生植物的特徵是具有大量的氣生根，它們分泌富含碳水化合物的粘液。對黏液菌群的分析表明，它富集了許多已知的固氮菌的類群，富集了編碼固氮酶亞基的同源性基因，且擁有能被乙炔還原法和¹⁵N₂摻入法測定的固氮酶活性。在Sierra Mixe的田間試驗中，使用¹⁵N自然丰度法或5年的¹⁵N富集方法評估表明，大氣固氮對Sierra Mixe玉米氮素營養的貢獻率為29% ~ 82%

作者總結

氮是植物必需的養分，對於許多非豆科作物來說，對氮的需求主要通過無機肥料的供應來滿足。這些肥料是通過能源密集型過程從化石燃料中生產出來的，估計使用了全球總能源供應的1%到2%，併產生了等量的溫室氣體。因為玉米(Zea mays L.)是氮肥的重要接受者，幾十年來的一個研究目標是確定或設計這種與作物有關的生物固定大氣氮的機制。我們推測，在低氮營養條件下，使用傳統方法種植的、很少施肥或不施肥的被篩選出的本地玉米品種可能已經進化出改善作物性能的策略。這裡，我們展示了一種生長在墨西哥瓦哈卡附近缺氮田地裡的玉米品種，其29%-82%的植物氮素來自大氣氮。高水平的固氮能力得到了支持，至少在一定程度上是由於與氣生根有關的富含糖的粘液大量的產出，其為複雜的固氮微生物群提供了一個家。

背景

植物生長與微生物群落密切相關，微生物群落影響著植物的營養獲取、植物發育、植物防禦和非生物脅迫反應等性狀。植物根相關菌群的特徵表明，其複雜程度遠低於周圍土壤的菌群，其中富含變形桿菌、擬桿菌和放線菌。這些微生物部分是由植物細胞壁特徵和宿主細胞的代謝信號選擇的。與27個現代玉米(Z. mays)自交系相關的根際微生物群落特徵也表明，土體土壤和根際微生物類群的相對丰度存在顯著差異，其中玉米基因型對根際選擇性的影響雖小，但意義重大。

一個多世紀以來，與非豆科植物，尤其是穀類植物有關的固氮微生物一直是人們感興趣的話題。在某些環境中，固氮內生菌有助於甘蔗的氮素營養，但在其他穀類作物中，有效的固氮類群證據較少。一項為期一年的基於Miscanthus × giganteus的¹⁵N稀釋實驗的研究表明，這種多年生生物能源的原料可以從空氣中獲得大約16%的氮。也有研究表明，模式穀物，狗尾草，以及粟(穀子)可以從與Azospirillum brasilense的組合中獲得大量的固定氮。其他被轉移到穀類的固定大氣中N

和Azospirillum sp.對不同玉米種質材料固氮的貢獻。然而，在這些研究中，通常很難區分這些固氮菌對植物生長的促進作用，即從固定的氮到寄主植物的實際轉移對產量的影響。評價固氮的常用技術有四種:乙炔還原測定(ARAs)法，¹⁵N自然丰度法,¹⁵N₂氣體富集法，以及氮平衡實驗方法。所有這些方法都有潛在的缺陷，但是很少有研究比較這些不同的技術或進行多年評估以評估非豆科植物的固氮能力。

Triplett認為，通過調查來自玉米起源地區的原始玉米種來鑑定玉米固氮內生菌可能是很件有趣的事情。Estrada和他的同事根據這一

我們還瞭解到，在瓦哈卡的Sierra Mixe地區，篩選出的本土玉米品種據報道是用很少或不施肥的傳統方法來種植的，並推測這種獨特的微生物群落組合（在種植的玉米中沒有發現）可能已經進化。這種本土玉米品種的特點是具有能產生大量粘液的大量氣生根。與玉米地下根系有關的黏液已在以前的研究中有所描述，表明根系分泌物在構建根際微生物群落中起著重要的作用。事實上，已有研究表明，豌豆根粘液可作為某些根際細菌的唯一碳源

結果

Sierra Mixe地區玉米的形態和粘液

Sierra Mixe maize morphology and mucilage

本地栽培的Sierra Mixe玉米品種如Rojo、Piedra Blanca和Llano，它們具有相似的植物形態，生長高度超過5米，每個節點上都有廣泛的氣生根形成。我們比較了Sierra Mixe玉米和另一種高大的玉米品種(Hickory

圖 1 Sierra Mixe玉米的生理特性

Physiological features of Sierra Mixe maize

(A) 在種植Sierra Mixe玉米(黑色條狀圖)和高大的heirloom Hickory King玉米(灰色條狀圖)5周後，幼齡期和成齡期之間的過渡(黑色箭頭)。(B)在美國，麥迪遜的田間生長14周後，Sierra Mixe玉米和Hickory King玉米上觀察到的氣生根數量。誤差線代表標準誤差;星號表示Sierra Mixe玉米和Hickory King玉米至之間差異顯著(Student t test, P< 0.01)。(Data at DOI: 10.6084/m9.figshare.

6534545).

圖 2 氣生根粘液

Aerial root mucilage

(A) Sierra Mixe玉米的氣生根(左)在種植後3 - 6個月期間分泌大量的粘液。粘液富含碳水化合物，主要成分為阿拉伯糖、巖藻糖和半乳糖(側幅)。

Sierra Mixe玉米的固氮菌群

通過對生長在Sierra Mixe地區的Sierra Mixe玉米進行16S rRNA基因的擴增和測序以及鳥槍宏基因組測序，研究了與其地下根和氣生根、莖以及氣生根黏液相關的微生物群。根際樣品多樣性最高，在植物樣品中，氣生根黏液多樣性最高，其中擬桿菌和變形桿菌相對丰度高於植物的其他部分。許多在黏液中過量表達的世系包括已知的與植物相關的固氮菌。基於總群落組成的樣本比較顯示，黏液樣本的聚類與其餘的植物和根際樣本在統計學上是不同的(圖 3A)。基於序列變體的方差穩定丰度的樣本聚類再次表明，雖然根際樣本具有差異性和多樣性，但粘液樣本與其他植物組織差異更大。在Sierra Mixe玉米和土壤樣品中被鑑定的所有序列變體的完整列表可在(DOI: 10.6084/

m9.figshare.47

圖 3 基於DNA序列的Sierra Mixe玉米的微生物區系特徵

DNA sequencing–based characterization of the

(A) 樣本由基於Bray-Curtis相異距離的矩陣進行PCoA聚類。通過PCR擴增和rRNA基因測序對細菌群落進行評估。每個點對應一個單獨的樣本。在vegan包中通過跑adonis 的Permanova分析表明，黏液樣品在統計學上是不同的(例如，粘液對根際P= 0.002，粘液對根P= 0.03，粘液對氣生根P= 0.03)。(B) 基於宏基因

Markov模型的hits次數來測量)。在黏液和根際文庫中核心nif基因的最低丰度。*僅僅在莖的庫中核心nif的hit。anfG和vnfG可選固氮酶僅在黏液庫中被觀察到。PCoA，主成分分析。

為了評估黏液中存在固氮微生物群落的可能性，用ARAs法和加入¹⁵N₂氣體法檢測粘液的固氮酶活性。ARA被用來評估生長在墨西哥或美國麥迪遜的Sierra Mixe玉米植株上採集的葉、莖、地下根、氣生根(含或不含粘液)和粘液。分泌粘液前，地下根、葉、莖、甚至氣生根均未被檢測到ARA活性。相反，在含有粘液的氣生根和生長在Sierra Mixe或Madis

從生長在麥迪遜的Sierra Mixe玉米中分離出的黏液的ARA活性表明，要麼Sierra Mixe玉米種子攜帶一種內源性的固氮細菌，要麼Sierra Mixe玉米可以從當地環境中招募足夠的固氮細菌。通過將¹⁵N₂直接摻入收集自Sierra Mixe玉米的黏液樣品中，測定了黏液樣品的固氮效果(圖 4B)。

圖 4 Sierra Mixe玉米黏液中固氮酶和N₂固定的活性

Nitrogenase and N2 fixation activity in mucilage produced by Sierra Mixe maize

(A) 從美國麥迪遜的Sierra Mixe地區或田間種植的植物中收集的各種Sierra Mixe玉米株系和墨西哥類蜀黍的黏液顯示出很強的乙炔還原活性。(-,沒有乙炔;+,10%乙炔)。星號表示差異顯著( P < 0.05;

** P < 0.01, Mann-Whitney test)。(B)通過同化¹⁵N₂表徵的Sierra Mixe玉米黏液中的固氮作用。從生長在Sierra Mixe地區的Sierra Mixe玉米中收集的粘液，在37℃、充滿¹⁵N₂或¹⁴N₂氣體的氣密瓶中孵育70小時。用IRMS法測定¹⁵N(過剩的原子%)。(C和D)當H.seropedicae和A. brasilense*被加入不固定的粘液中表現出乙炔還原活性，而在相同的添加了無菌培養基(-)粘液中或相同的沒有粘液的細菌(-)則沒有。(E) 粘液內8毫米處的氧濃度。顯示了平均值和標準誤差。不同的字母表示差異顯著(KruskalWallis test)。(Data at DOI: 10.6084/m9.figshare.6534545)。IRMS，同位素比質譜法。

和Sierra Mixe玉米一樣，一種野生近親，Z. mays ssp. mexicana（墨西哥類蜀黍） 也產生廣泛的氣生根，但分泌的粘液量少得多。為了測試墨西哥類蜀黍黏液支持固氮的能力，

為了評估支持固氮的粘液特性，我們測試了兩種系統發育上不同的固氮細菌在接種於收集自Sierra Mixe玉米氣生根的粘液中還原乙炔的能力。實驗前，將黏液在-80度凍結2周後解凍，以消除內源固氮酶活性(圖4C)。兩種固氮細菌，H. seropedicae和A.brasilense，在加入到粘液中時，很容易檢測到ARA的活性(圖4C和4D)。細菌固氮酶對O₂

Burkholderia unamae在重建的粘液中顯示出明顯的ARA活性，表明

根據ARA，我們可以得出結論，來自Sierra Mixe玉米的粘液中含有原生的固氮菌，且也可以支持外源接種的固氮菌H. seropedicae、A. brasilense和B. unamae的固氮活性。然而，這些數據並不能證明氣生根具有攝入和同化被固定的氮的能力。為了測試黏液相關固氮菌固定的大氣N₂是否能被Sierra Mixe玉米轉移和利用，我們進行了更直接的¹⁵N₂氣體富集實驗。與經¹⁴N₂氣體處理的根相比，接種了A. brasilense Sp7的氣生根及其產生的粘液表現出顯著的¹⁵N₂氣體的融入(圖 5)，同位素比質譜(IRMS)分析證實，與陰性對照相比，這些根的葉綠素(轉化為脫鎂葉綠素進行分析)顯著富集了

圖 5 Sierra Mixe玉米樣品中¹⁵N₂在粘液、氣生根和來自氣生根的脫鎂葉綠素中富集的分析

Analysis of Sierra Mixe maize samples for 15N2 enrichment in mucilage, aerial roots, and pheophytin from aerial roots

(A) 粘液從氣生根中產生，並接種A. brasilense Sp7。注入

固氮促進玉米氮素營養

Nitrogen fixation contributes to maize N nutrition

¹⁵N₂從黏液轉移到氣生根組織和葉綠素，表明了這種固氮群落對植物氮營養的貢獻潛力，但本研究的一個主要問題是，在田間條件下，黏液相關的固氮菌群是否能夠轉移固定的氮，至少部分滿足Sierra Mixe玉米的減少的氮需求。利用自然丰度¹⁵N測定法，首次在田間估算了大氣固氮對Sierra Mixe玉米的貢獻。這種方法依賴於大氣和土壤中穩定同位素¹⁵N的相對丰度，土壤中的¹⁵N丰度比空氣中的豐富。因此，與參考非固定氮素的植物相比，從大氣中吸收N的植物顯示出降低的δ¹⁵N水平。2006年，收集了來自兩塊田的相鄰生長的菊科和毛茛科(沒有已知固氮成員的科)的Sierra Mixe玉米和參考植物樣本。在這個初步實驗中，Sierra Mixe玉米δ¹⁵N明顯低於參考植物,表明大氣中氮的同化。在2010年、2011年和2012年，通過對生長在Sierra Mixe玉米植株附近的非固氮植物和傳統玉米品種Maiz Blanco Conasupo的參考種進行採樣，這些方法被用於Sierra Mixe的實驗。除了確定來自每個玉米和參考植物樣本的δ

表 1 自然丰度¹⁵N的測定

Natural abundance 15N determinations

(A) 在種植三個月後Sierra Mixe玉米、傳統玉米品種(Maiz Blanco Conasupo)以及生長在Sierra Mixe地區的參考植物的δ¹⁵N值。數值以平均值和標準差表示。參考植物，Maiz Blanco Conasupo和Z. maysS. Mixe的平均值使用學生t檢驗 (p< 0.05)進行了統計比較。不同的字母表示差異顯著。(B) 在2011年和2012年間，種植於Sierra Mixe地區田塊1、2的Sierra Mixe玉米植株在種植後第2，3，4，5，6個月的δ

由於參考植物和試驗植物的根和莖生長的差異和物候現象的差異以及在土壤中發現的δ¹⁵N範圍有限，因此使用自然丰度¹⁵N和其他物種作為參考植物來計算％Ndfa的方法可能受到限制。另一種方法，¹⁵N富集,是類似於自然丰度方法，但是通過添加¹⁵N肥料使土壤富集¹⁵N,從而增加土壤和大氣之間δ¹⁵N的差異和檢測靈敏度。幾次直接比較表明，這兩種方法的結果可以比較，但略有不同。

另一種估算N₂固定的方法是N差異法，它決定了一個固氮植物的總N含量與一個參考非固氮植物的總N含量的差值。總氮是用特定植物樣本中總氮含量(%)與植物產生的總生物量(kg/ha或kg)的乘積來計算的。%Ndiff的計算方法如材料和方法中所述。

在2016年和2017年，在3個低氮ierra Mixe田中的完全隨機區組設計(5個重複)中我們採用¹⁵N同位素富集方法（1％-10％富集）在3個營養生長期V9，V12和抽穗期上評估大氣固氮，並在2017年的抽穗期在相同的田塊採用相同設計(表 2)。在2016年，田塊3僅在抽穗期SM2的 Atom%¹⁵N產生顯著的差異，而發芽期的N在2016年和2017年都有顯著差異。2016年，4號田的Sierra Mixe玉米品種在(玉米生產歷史為1 - 2年)抽穗期和V9期的Atom%15N水平顯著低於對照植株，==and at Tassel in both years for shoot N==。2016年和2017年，5號田(玉米連續種植3年以上)的Sierra Mixe玉米各品種在各採樣階段的Atom%¹⁵N和==shoot N==含量均顯著降低，說明這些試驗中存在顯著的大氣固氮水平。計算得到的Ndfa %在31% ~ 55%之間，Ndiff在29% ~ 82%之間。Ndiff與Ndfa在2016年和2017年的相關係數分別為0.55和0.44 (P< 0.01)。氮固定的有效的方法是由6個Atom%¹⁵N N測定實驗(Ndfa)中的4個及6個Ndiff 測定實驗中的6個測定的。對照雜種和地方品種在根和芽的生物量、高度和莖粗之間存在顯著差異。土壤分析顯示，所有地點的土壤氮均已耗盡，但作物產量仍超過2000公斤/公頃。三塊田的不同輪作階段(玉米連續生產0 ~ >4年)的微生物群的差異可能是導致田間和年際差異的原因，但要

討論

我們已經證明，與Sierra Mixe玉米氣生根相關的黏液可以支持一個複雜的固氮菌群，該菌群富含編碼固氮酶亞基的基因同源物，這些基因亞基具有活躍的固氮酶活性，氮能有效地從固氮細菌轉移到寄主植物組織中。總的來說，經過數年和不同的地點，一個Sierra Mixe本地玉米品種的2個選擇的¹⁵N自然丰度和¹⁵N富集結果表明，在當地環境中生長時，其氮素營養可以通過固定大氣中的氮得以部分滿足。固氮是一種特別難以評估的表型，因為所有可用的技術都容易產生人為因素，並能給出不同的固氮估計。在這項研究中，我們對Sierra Mixe玉米使用了幾種經典技術，並在多個地點和多年的研究中證明，Sierra Mixe玉米能夠以我們

本研究還揭示了氣生根及其產生的粘液在防止倒伏和吸水之外的一種新的重要功能。對於不觸及地面的氣生根來說，這種固氮的作用可能是其最重要的一個作用。探索高粱等其他穀物產生的氣生根是否也有類似的功能，將是一件有趣的事情。我們不能排除Sierra Mixe玉米其他部分的固氮活性也可能有助於從大氣中獲得還原態的氮。在氣生根廣泛發育之前，在Sierra Mixe玉米植株中出現的固定大氣N₂的發育時間表明，可能確實存在更多的固氮位點。然而，在氣生根粘液的外面,我們沒有檢測到任何顯著的氮酶活性。

該性狀的遺傳基礎或微生物接種的來源，可能是環境或種子傳播的，尚未得到解決。我們觀察到的一種墨西哥類蜀黍品種(

材料與方法

Materials and Methods

種植物料

Plant material

Sierra Mixe玉米種子來自墨西哥瓦哈卡的Sierra Mixe地區，來自開放授粉的種群。Z. mays ssp. mexicana(墨西哥類蜀黍), LH

PH207, 以及B73種子來源於美國農業部國家植物種質系統(NPGS)(登錄號分別為:8083、PI601079、PI558532、PI600981、PI601170、PI601005、PI550473)。玉米line Hickory King從Victory Seeds獲得（登錄號 3140041）。Tornado-F21 and H-377 來自瓦哈卡的Semillas Ceres。SM1和SM2是來自Sierra Mixe 品種的不同的選擇。SM1是基於內核大小、形狀和顏色的均勻種群，而SM2是一個代表當地品種的異質群體。

生物材料是根據Sierra Mixe團體和BioN2公司之間的准入和利益共享協議而獲取和使用的，並得到了墨西哥政府的許可。已經針對此類活動簽發了國際認可的《名古屋議定書》規定的遵守證書（ABSCH-IRCC-MX-20

菌株和培養基

Bacterial strains and media

A. brasilense Sp7和B. unamae MTI-641分別由G. Alexandre博士(美國田納西州大學諾克斯維爾分校)和A. Hirsch博士(美國加州大學洛杉磯分校分校)提供。H. seropedicae Z152(ATCC 35894)由ATCC( http://www.atcc.org/ )提供。細菌被培養在液體BSE培養基中。

樣品收集

Sample collection

分別於2010年、2011年和2012年對Sierra Mixe地區田塊1、2中的Sierra Mixe玉米的根際和植物組織(包括莖、葉、氣生根、地下根和粘液)進行取樣。對於植物內生菌分析，用mqH

植物表型分析

Plant phenotyping

每週(溫室)或14周後(田間)監測有氣生根節點的數量。14周後測定氣生根總數。每週監測葉蠟的消失和毛狀體的出現，以確定Sierra Mixe和Hickory King 玉米幼體和成體的過渡時期。

溫室和田間試驗（美國麥迪遜）

Greenhouse and field experiments, Madison, USA

對於溫室中的實驗，將1、2號田的Sierra Mixe種子以及Hickory King種子表面消毒進行如之前所述的發芽試驗。1周後，幼苗被移栽到40升的花盆中，花盆中填滿沙子和珍珠岩(v:v)，然後置於生物氣候室(美國威斯康星大學麥迪遜分校)的高天花板溫室中生長。每天給植物澆兩次強度為霍格蘭溶液一半的水溶液，每次2分鐘。為了進行田間試驗，種植了每個

粘液糖基的組成

Mucilage glycosyl composition

採用氣相色譜-質譜聯用技術(GC/MS)對由樣品經酸性甲醇分解得到的單糖甲基苷的鄰三甲基硅(TMS)衍生物進行糖基組成分析。首先從在1 M HCl甲醇中經80 ˚C

(18–22 hours)條件下乙酰化的乾燥粘液樣品中製備甲基糖苷，然後在甲醇中與吡啶和乙酸酐進行re-N-乙酰化反應(對於檢測氨基糖)。然後在80度(0.5小時)高溫下，用trio - sil (Pierce)對樣品進行per- o -三甲基硅化反應處理。在連接5975b MSD的HP 6890 GC上採用一根All Tech EC-1熔融石英毛細管柱(30 m×0.25 mm ID)進行甲基糖苷的GC/MS分析。該分析是在

DAN的提取

DNA extraction

使用DNA提取試劑盒(Mo Bio Laboratories, Carlsbad, USA)從100毫克的根際植物組織中提取DNA(80–150 ng μl⁻¹)。對16S rRNA基因進行微生物DNA分離的PCR對照。用真菌引物27F (50-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-30)和1492R (50-GGTTACCTTGTTACGACTT-

30)進行PCR，產物是一個大約1450個bp片段。使用正反引物各1μM，3mM MgCl2，每一種dNTP各20 μM，1.25單位的聚合酶(Promega)與1X的反應緩衝液(Promega, Madison, USA)混合成20 μl 的體系。PCR條件為95 ˚C 預變性3分鐘，之後在94 ˚C變性1分鐘，56 ˚C退火一分鐘，72 ˚C延伸1.5分鐘的條件下進行35個循環，最終再進行72 ˚C延伸7分鐘。在100 V下運行30分鐘的瓊脂糖凝膠電泳解析DNA，分別用於分析總DNA和擴增PCR產物。在凝膠記錄系統中，用溴化乙錠染色在紫外線下觀察凝膠。

基於illumina的16S rRNA基因測序

Illumina-based 16S rRNA gene sequencing

採用Caporaso方法對根際和植物組織進行16S rRNA基因PCR和測序。我們將Caporaso方法擴展到每個樣本雙條形碼的方案，並將Golay條形碼替換為一組不同的與illumina兼容的條形碼，這些條形碼的設計目的是平衡鹼基組成和容忍條形碼序列中最多4個排序錯誤。所使用的前置引物為AATGATACGGCGACCACCGA

GATCTACAC[Barcode]TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA, 反向引物為CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[Barcode]AGTCAGTCAGCCGGACTA

CHVGGGTWTCTAAT。所使用的條形碼被設計成允許在一次MiSeq運行中彙集多個樣本。在退火溫度(55˚C)下進行10次條形碼引物PCR;然後使用Qiagen柱收集和清潔樣品，以去除未合併的引物。在這一階段，我們使用Illumina雙端的flowcell引物在較高的退火溫度(65 ˚C)條件下進行了10或20個循環的PCR反應。所得的PCR產物用Agilent Bioanalyzer 進行QC，使用 KAPA Biosystems qPCR試劑盒估計其濃度。樣品被稀釋到MiSeq運行所需合適的裝載濃度，加入25%的phiX控制庫，使用製造商標準的150個核苷酸雙端雙指標測序協議和定製的測序引物，通過Illumina MiSeq儀器進行測序。

Illumina序列來自2次MiSeq測試(2X150 bp雙端)，並使用自定義腳本進行多路解析(https://figshare.com/s/04997ae7f7d18b53174a)。如此獲得的822,804個讀長被修剪成phred-等效的20，然後使用BBDuk過濾掉接頭汙染(工具包 https://sourceforge.net/projects/bbmap/)。由於反向配對的質量較差，因此在分析中使用了正向配對的讀長。然後使用DADA2對讀長進行預處理和分析。使用了規定的標準過濾參數，如PhiX汙染檢查和去除有兩個以上錯誤的或有模糊鹼基或預期錯誤大於2的讀長。利用DADA2的removebimenovo功能識別並去除嵌合體。然後利用RDP訓練集將乾淨的讀長分解為序列變量並進行分類(version14)。被歸類為葉綠體或線粒體的序列變體被從進一步的分析中去除。從大小範圍為84到20597讀長(平均4703)的文庫樣本中，識別出995個獨特的序列變體。

Alpha和Beta多樣性指標是使用Phyloseq 3.4.2 R包生成的。利用Shannon和Simpson指數計算Alpha多樣性。此外，使用基於Bray-Curtis差異矩陣的PCoA圖來可視化樣本間的差異。在DESeq2中，通過在DESeq2中進行穩定變量轉換之後，序列變量表被用於生成一個熱圖。使用vegan 3.4.3.R程序包(https://CRAN.R-project.org/package=vegan) 中的adonis功能進行置換檢驗來執行NMDS排序。

宏基因組測序

Metagenomic sequencing

採用一種自適應的基於Nextera轉座酶的文庫構建方法，採用多重條形碼技術，從上述相同的DNA提取中獲得Illumina測序文庫。然後在MiSeq和HiSeq儀器上對樣品進行測序。如此獲得的Illumina序列使用Trimmomatic (ver 0.33)進行解析和裁剪，參數如下：Illuminaclip 2:30:10, Headcrop:15, Leading:20, Trailing:20, Sliding window:4:20, and Minlen:100. 然後使用針對PhiX基因組(Genbank acc# NC_001422.1)和Z. mays 栽培品種B73草圖基因組(RefSeq assembly acc#GCF_000005005.2)的Bowtie2比對器，針對PhiX和玉米序列(基因組、葉綠體和線粒體)篩選讀長。利用含有nr數據庫的Kaiju方法對乾淨讀長進行分類。為了計算樣本的beta多樣性，我們使用了Phylosift (ver 1.0.1)，它識別並定位了匹配到參考樹上的37個保守系統發育標記基因的讀長。從這些位置，使用Guppy進行了Edge-PCA分析。

Nif基因搜索

Nif gene search

我們從GenPept中檢索了以前發表的已知固氮菌的6個核心nif基因(nifH、nifD、nifE、nifK、nifN、nifB)和備擇固氮酶(anfG、vnfG)的肽序列作為參考。使用ClustalW2生成這些序列的多序列比對作為參考比對。針對這些參考序列進行了6個框架翻譯的宏基因組讀長的blast搜索。然後使用clustal-Omega根據參考的多序列比對對 hits 進行比對，然後使用具有氨基酸進化和gamma20似然的WAG模型的Fasttree2.1為每個nif基因生成系統發育樹。如果這些讀長在參考序列的分支內，則被認為屬於nif基因。每一個與核心nif基因

乙炔還原法ARA

Acetylene Reduction Assay ARA

對於黏液的ARA，從1或2個氣生根Sierra

Mixe) 或生長在田間的幾種植物（墨西哥類蜀黍）上收集新鮮的2毫升黏液，將其裝入14.5毫升的小瓶(Wheaton, Millville, USA)中，並緊緊封閉。對於添加了細菌的ARA，A. brasilense、H. seropedicae和B. unamae在BSE培養基中被培養48小時。然後通過離心(5min, 4000×g)收集細菌並重懸在Fahraeus培養基中。將最終OD_600nm= 0.01的菌懸液接種到14.5 ml的小瓶中，每個小瓶裝有5ml的黏液，被預先在-20℃下數月以減少內源性固氮細菌。

對照管為不含細菌或用5ml Fahraeus培養基代替粘液而製備。然後,將850μl乙炔(氣體)注入每個瓶。72小時後測量每管OD

KCL柱(Restek)的氣相色譜上(GC-2010 Shimadzu)。

粘液對15N2的吸收

Mucilage ¹⁵N₂assimilation

¹⁵N原子在黏液中的富集是通過將4ml的頂空氣體移出並用4ml的¹⁵N₂(Sigma-Aldrich)或¹⁴N₂氮氣直接注入含有1.0 ml黏液的小瓶中來實現的。從生長在Sierra Mixe地區的Sierra Mixe玉米植株上採集粘液，在取樣至測定¹⁵

自由氧濃度的測量

Measurement of free-oxygen concentration

對於收集的粘液的測量，在15毫升的試管中注入2毫升粘液。探針(魯棒氧微探針，Pyroscience)被引入8毫米深的粘液進行氧的測量，直到穩定

15N2富集實驗

¹⁵N₂gas–enrichment experiments

氣生根是從生長在Biotron溫室設施的Sierra Mixe玉米中採集的(University of Wisconsin, Madison, USA)。這些氣生根在室溫下5ml水中培養48小時，產生粘液。粘液與氣生根一起，被接種A. brasilense Sp7。然後，將10%-15% (v/v)地¹⁵N₂氣注入小瓶，30℃孵育48小時。在單獨培養粘液或單獨培養氣生根後，對從這些氣生根中提取的脫鎂葉綠素進行IRMS分析。為了獲得脫鎂葉綠素，從氣生根中提取葉綠素，經酸性處理轉化為脫鎂葉綠素，如下所示。

¹⁵N自然丰度法

¹⁵N natural abundance

生物固氮(%Ndfa) 所佔比例(%)由Sierra Mixe玉米(δ¹⁵N_{fixing plant})和參考植物種(δ¹⁵N_ref)的¹⁵N自然丰度(以delta為單位表示，‰)估算得到的。在Sierra Mixe的2011和2012年每個野外季節，我們分析了代表8-10種(視年份而定)非固氮植物地90-114個單獨的玉米樣本(視年份而定)和270個參考植物樣本。在2010年的單時間點，我們分析了代表8種非固氮植物的12個玉米個體樣本和33個參考植物樣本。利用 FTA Plant Saver卡採集的DNA進行通用18S PCR分析，同時採集

“δ¹⁵N”是指穩定氮同位素，ref”是來自非固N參考植物的值，“fixing plant”是Sierra Mixe玉米，“B”是空氣中的¹⁵N丰度，假設為0。

¹⁵N富集的田間實驗

¹⁵N-enrichment field experiments

2016年選擇了3個地點:田塊3，超過十年未種莊稼的土地;田塊4，種了一年玉米的土地;田塊5，一直種植玉米的土地。在每個試驗點建立一個完全隨機區組試驗設計，5個重複，4個品種。每個地塊由6個matas組成，其四周由SM2的共同邊界和外圍的雙邊界包圍。mata是Sierra Mixe地區傳統的種植設計，類似於山上的一塊地，在那裡多種植物被播種在一起。每個mata種植5粒種子，對於每塊地種植18株植物的則稀疏為3粒種子

2017年，除了田塊3只有H377和SM2的記錄，同樣的3個地點以同樣的設計和記錄被種植。在這三個田塊中，¹⁵N以0.95克/塊的劑量施用，達到所需大於1%的富集。通過使用花園噴壺，一種溶液均勻地被灑在每一塊土地上，以至於整個實驗區獲得等量的¹⁵N富集。在施用時(V5)，用塑料袋將植物覆蓋，以確保¹⁵N不直接施用於葉子上，而所有植物均可獲得¹⁵N。

土壤樣本取自每個地塊0-60釐米的深度，混合後送到加州大學戴維斯分校土壤實驗室進行分析。計算不同地點的平均值。2016年，在V9和V12，取樣1個mata(3個植物)；在抽穗期，取4個樣品（12種植物）。2017年，在抽穗期對6個matas（18種植物）進行了單次抽樣。每次取樣時，都要挖出植物以包括所有的根。由於高降雨量(2,100毫米，集中在從6月到10月得生長季節)，因此無論是參考和測試品種其根是淺的。對每個植株拍照，並記錄植株數量、株高、嫩枝總鮮重、根和莖粗的數據。將整株植物切碎，磨碎，取樣，在烤箱中乾燥，以記錄芽和根的總乾重。混合良好的子樣本被取走並運送到Davis處測量總氮和

13cand15n.html)進行。

%Ndfa採用¹⁵N富集法計算，如

Atom% 過剩是用來自加州大學戴維斯分校的Stable Isotope Facility– 0.37(空氣中的氮)的樣品值計算出的。

氮差(%NDiff)計算方法為

以Tornado F21 and H377 的平均值為參考，計算了%Ndfa和% Ndiff。對於Ndiff的計算，根據每個時間點收穫的matas調整來收穫的面積。

田間數據分析

Field data analyses

使用R lme4軟件包進行數據分析。檢查數據的異常值，並使用最小顯著差異法（p= 0.05）對每個地點的數據進行ANOVA和均值比較。只有當ANOVA F-tests在

編譯：馬騰飛 南京農業大學

Reference

Van Deynze A, Zamora P, Delaux P-M, Heitmann C, Jayaraman D, Rajasekar S, et al. (2018) Nitrogen fixation in a landrace of maize is supported by a mucilage-associated diazotrophic microbiota. PLoS Biol 16(8): e2006352.doi:10.1371/journal.pbio.2006352

PLOS Biology: 發現一種固氮玉米

https://mp.weixin.qq.com/s/hLFHUryPyHiO1JaOuHf0hA

中國科學：玉米可利用氣生根進行高效生物固氮

https://mp.weixin.qq.com/s/iIRn2bthKAgZ

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