單B細胞平臺種類：包括基於FACS、液滴微流控、微印記、微流控小室等技術的平臺；
關注重點：各單B細胞平臺都可以實現對單B細胞不同程度的高通量篩選，而基於微流控技術的各平臺也展現了其高靈敏度的優勢。但能否更高效的應用於新型抗體分子的發現，in-chip assay的能力則是需要進一步考慮的關鍵點：如果單B細胞平臺能實現從特異性到功能性的篩選、並保證assay結果的準確度，則會提高總體篩選的工作效率、減少下游表達驗證的工作量、縮短抗體發現的週期。而通過比較可以發現，Beacon平臺在assay的種類、操作自動化、結果準確性上面都具有明顯的優勢。
上一篇我們介紹了單B細胞平臺相比於傳統抗體藥發現平臺的優勢和特點（從三個月到24小時？一文詳解單B細胞分選技術及其優勢（上））。那麼，市場上有哪些單B細胞平臺可以為我們所用呢？
市場上的單B細胞技術平臺
基於FACS技術 (FACS-based)
FACS多色分選技術是由Len Herzenberg團隊在1960年代基於流式細胞儀發展出的流式細胞分選[1]。FACS利用熒光標記的抗體針對B細胞表面標記物進行染色, 通過流體動力聚焦和換能器的振動將流體割裂成微液滴，每一個液滴中包含等待被分選的B淋巴細胞。這些液滴通過激光產生分選信號，滿足篩選條件的B細胞帶電液滴最後將被靜電場引導到收集管中。抗原結合B細胞被回收後，可被刺激培養並分泌抗體、基於細胞上清的二次篩選、測序與表達。這一平臺的優勢在於通量較高（10,000 cells/s），技術十分成熟、易於搭建，國內外已有多家公司佈局了基於該平臺的單B細胞克隆技術。但該技術的限制也同樣明顯，如靈敏度低、檢測噪音高等，導致在後續驗證環節中，所篩選出的克隆驗證陽性率較低；而且，由於在篩選期間檢測手段較為受限，下游驗證範圍較大，涉及到後期大量的克隆和驗證工作。
基於液滴微流控技術 (Microdroplet-based)
基於液滴微流控的單B細胞篩選是指使用油包水液滴將候選細胞進行單細胞包裹，確保其單克隆性，同時將檢測所需底物也一同包裹在內，然後對每個液滴進行基於熒光激發的分析與篩選。這一平臺的篩選通量也非常高——每秒可達數百個細胞。但這一技術的限制在於檢測手段：在目前的研發進展中，只能使用基於均相的檢測方法，即無法進一步檢測抗體對細胞表面受體的結合或阻斷。同時，一般來說包裹於微液滴的細胞活力難以維持，對實驗的流程要求較高。目前，Abcellera[2]、Sphere Fluidics[3]等公司搭建的就是基於該類技術的平臺。
圖1：基於微液滴的單B細胞平臺[4]
基於微印跡技術(Microengraved-based)
這一技術由MIT的Christopher Love及其團隊開創，又稱為SCAN(Single cell antibody nanowells)[5] 。該平臺使用軟光刻技術，利用PDMS原料在玻璃表面構建出一個個體積約為0.1-1nL的空間，將單b細胞分隔在這些空間中，同時，將附有檢測試劑（如抗原、二抗）的表面覆蓋於上述表面上，使各單克隆B細胞分泌的抗體參與反應、產生信號，從而達成篩選目的。從該技術的操作過程可以發現，其主要受限於：對於每批細胞，檢測方式自動化程度低，導致篩選週期相對較長，且無法滿足基於細胞的檢測需求。
圖2 基於微印記技術的單B細胞平臺[5]
基於微流控小室技術(Microfluidic chamber-based)
在利用該技術搭建的平臺中，來自於Berkeley Lights公司的Beacon單細胞光導系統可謂獨佔鰲頭，得到了包括Amgen、Novartis、Pfizer等跨國大型藥企的青睞。在此，我們通過分析Beacon的原理和工作流程來闡述這一類型的技術：1. 在抗體分泌細胞經過富集後，Beacon平臺通過微流控系統將其輸送到芯片部位，並且通過重力或光誘導的雙向電泳（光導）將單細胞分離到芯片的各個小室中；2. 使用基於磁珠的雙色熒光結合實驗檢各細胞的分泌物，如果細胞能夠分泌抗原特異性抗體，則會產生熒光信號，被儀器識別，在這一步驟中，檢測試驗可以根據需求進行靈活調整，比如改變檢測方式、調整抗原形式等；3. 單個陽性細胞通過光誘導的雙向電泳被吸取出來，輸送到96孔板中，進行進一步的測序、表達。
可以看出，通過整合微流控技術、信號檢測系統和光誘導的雙向電泳技術，Beacon可以實現自動化的單細胞分選、培養、檢測和收集[6]。除了全自動的細胞操控、有效減少人為誤差之外，Beacon平臺脫穎而出的另一個優勢在於，它
可以實現in-chip的多重檢測：不僅可以完成基於磁珠的抗原抗體特異性結合檢測，也可以利用抗原過表達細胞系檢測抗體與細胞表面抗原的結合。除此以外，Beacon可以實現更豐富的功能性篩選，包括阻斷實驗、交叉活性，表位驗證等。另外，不僅檢測類型多樣，檢測的靈敏度也極高，可達1pmol抗體濃度，同時可以記錄動態的檢測過程（可以觀測到信號隨時間的變化）；準確度方面，由於Beacon使用了光導技術實現了對細胞的精準操控，下游驗證實驗中證明假陽性大大低於其他篩選平臺的平均水平，陽性率達到99%-100%。
圖3 Beacon單B細胞分選平臺[6]
我們將各平臺的特點列表比較如下。可以看出，各單B細胞平臺都可以實現對單B細胞不同程度的高通量篩選，而基於微流控技術的各平臺也展現了其高靈敏度的優勢。但能否更高效的應用於新型抗體分子的發現，則需要考慮到抗體藥開發是一個整體工程，而不僅僅是篩選binder，所以in-chip assay的能力是需要考慮的關鍵點：如果單B細胞平臺能實現從特異性到功能性的篩選、並保證assay結果的準確度，則會提高總體篩選的工作效率、減少下游表達驗證的工作量、縮短抗體發現的週期。而通過比較可以發現，Beacon平臺在assay的種類、操作自動化、結果準確性上面都具有明顯的優勢。
表1 各單B細胞平臺比較
金斯瑞於2019年底引進了Beacon單細胞光導系統，是亞太地區首家擁有此設備的CDMO公司。在上篇最開始提到的應急抗體篩選中，金斯瑞正是藉助於該系統，同時整合了其近20餘年的抗體發現經驗，在12小時內快速篩選出了特異性識別病毒蛋白和有潛力阻斷病毒結合細胞受體的多個抗體（刷新記錄24小時，金斯瑞急速助力抗新型冠狀病毒抗體篩選取得突破性進展 ）。未來，金斯瑞會進一步將該系統整合進抗體發現平臺中，打造出高效的全人抗體開發平臺。
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參考文獻
[1] L.L. Lanier, Just the FACS, J. Immunol. 2014
[2] www.abcellera.com
[3] www.spherefluidics.com
[4] E. Brouzes et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. PNAS. 106 (34) 2009
[5] J.C. Love et al. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies, Nat. biotechnol. 24 (6) 2006
[6] www.berkeleylights.com
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