01.04 單細胞基因組學助力人類細胞表型的研究

撰文 | 覺主在路上

細胞是組成人類個體的基本單位，因其生長環境、遺傳背景等因素的不同而構成了不同的個體，進而形成個體差異。每個個體的不同表現形式被稱作為表型（Phenotype），它是個體基因型與其環境相互作用而產生的一系列特性進行分類的一種方式。因此，瞭解和分析組成個體的所有單個細胞的生活軌跡，比如它們是如何發育生長、在不同個體之間存在的差異、在疾病過程中的具有怎樣的功能障礙，對於人們對人類細胞表型以及個體差異的理解具有重要的意義。近年來，單細胞基因組學（Single-cell genomics）因為其能夠提供大量檢測方法及高通量數據而備受重視。

2019年9月27日，來自瑞士巴塞爾分子與臨床眼科研究所負責人J. Gray Camp和瑞士蘇黎世聯邦理工學院的Barbara Treutlein教授在Science的Genotype to Phenotype特刊上共同撰文Mapping human cell phenotypes to genotypes with single-cell genomics，總結了如何將單細胞基因組學應用於人類表型的研究。

1、單細胞表型分析策略

人類表型分析的大體策略是從單個細胞開始，在分子水平上分析其狀態，進一步整合至每種組織、整個系統水平，由此對個體進行表型總結。因此，單個細胞狀態的分析就成為了重中之重，而單細胞測序技術（Single-cell sequencing technologies）為此提供了可能。單細胞測序技術能夠同時檢測上千種細胞中每種細胞的上千種特徵，能夠對每個細胞特徵進行量化。目前的技術手段能夠在單個細胞中實現對RNA表達、DNA測序、甲基化狀態、染色質結構及可接近性和蛋白質組成進行檢測分析【1】。除了檢測單細胞的這些分子特徵，單細胞測序技術還能夠幫助進行細胞正常和疾病狀態的譜系示蹤【2,3】。除此之外，還可通過使用RNA雜交技術、蛋白質免疫組織化學技術、原位測序、質譜等技術對單細胞空間轉錄組、蛋白組學等信息進行補充。將這些技術進一步整合至組織當中，可以對組織和器官內不同區域以及不同階段的的細胞特徵進行分析【4】，即在時間和空間上都能夠檢測細胞狀態。當整合這些單細胞信息之後，細胞表型可以被總結分類，從而獲得細胞表型信息。這種通過單細胞測序方法整合從單細胞水平到組織系統水平的一系列整合分析從而獲取細胞表型信息的方法則為單細胞表型分析（single cell phenotyping），其優勢是能夠將細胞形態和分子水平特徵相結合，幫助對細胞類型進行分類，追蹤細胞狀態和譜系，從空間和時間上對組織內細胞異質性進行深層次分析。

2. 單細胞表型分析在疾病研究中的應用

單細胞表型分析不但能夠應用於正常細胞、組織器官內，更重要的是在疾病發生髮展過程中的應用，它能夠幫助人們理解基因改變是如何參與疾病發生髮展的。疾病相關的診斷通常是檢測自然發生的基因突變，這些基因突變能夠引起特定的一些細胞表型的變化，而人們則將具有這一類的表型變化的疾病人群歸類，定義為由此基因突變而導致的表型變化

3. 單細胞表型分析與類器官和基因編輯方法的聯合

近年來，隨著生物技術的高速發展，類器官（organoids，詳見Science類器官特刊：1. Science類器官特刊（一）丨類器官新技術——類器官和器官芯片的完美結合；2. Science類器官特刊（二） | 胚胎幹細胞自組裝：哺乳動物的早期胚胎髮育；3. Science類器官特刊（三） | 當類器官技術遇上腫瘤）和基因編輯（CRISPR/Cas9，詳見：特別推薦丨鹼基編輯系統研究進展）方法的出現使得單細胞表型分析地應用更具全面性和可操作性。

類器官是在由幹細胞分化生長而成的能夠在體外進行3D培養的結構【9】。通過單細胞基因組技術分析後發現，這些體外培養的類器官能夠高度還原體內健康組織和疾病狀態下組織器官的細胞狀態，包括分子水平和表型【10】。單細胞基因組技術為類器官提供有力的證據，使其被認為是在體外模擬個體組織發育和疾病發生髮展過程中最好的研究工具。比如最近的研究發現，體外腦類器官培養能夠在體外重塑人體內發現的神經元遷移缺陷，這將很大程度地解決體內組織材料稀缺以及體內研究過程中難以操作地問題

CRISPR/Cas9編輯方法使得在體外培養的細胞株和類器官培養體系中有效的基因編輯成為可能 【14】。目前結合基因編輯和單細胞分析技術的主要類型可分為四類。正向遺傳學方法，已知致病基因，對致病基因進行一定的編輯，進而對下游表型變化進行分析；反向遺傳學方法，主要通過CRISPR篩選基因（pooled CRISPR screens）技術與單細胞測序技術相結合，將CRISPR gRNAs靶向成百上千個不同的基因，同時編輯許多細胞，然後實驗篩選編輯細胞，進一步運用單細胞測序技術進行分子和表型分析，從而篩選對於生物學作用機制有至關重要的作用的基因和表型【14】；單細胞遺傳學方法，即將多種不同gRNA轉入細胞後使細胞表達不同的gRNA，然後通過對不同細胞表達gRNA或者其特定標誌的條形碼進行單細胞測序，從而能夠在一次實驗中獲得所有基因的作用【15】；CRISPR/Cas9能夠對大量的細胞添加不同的生物條形碼，實現對不同的細胞進行不同的標記，並且這種標記能夠遺傳給後代子細胞，即誘導DNA瘢痕序列，或通過對Cas9蛋白進行熒光或誘導化學發光技術，結合單細胞測序技術進行追蹤細胞譜系。

4. 總結與展望

本綜述將當前基於單細胞基因組學進行表型分析的發展狀況進行了總結，並結合類器官和CRISPR基因編輯技術，對多種技術相互之間如何促進研究發展並結合多項成功案例進行了闡述。作者相信，通過使用單細胞基因組學技術，將來的科學研究能夠做到對所有細胞表型進行分類，並能夠清楚的指出在組織內處於任何空間任何時間狀態的一個細胞的分子特徵和這個細胞與其周圍環境之間的相互作用關係。而目前短期的研究目標和挑戰則是如何將所有檢測過程中的細胞分子特徵如RNA、DNA、染色質狀態或是譜系信息在組織空間結構中找到相對應的位置。除了科學研究的發展，單細胞基因組學面臨的另一大挑戰是如何更好的應用於臨床，比如操作流程的優化、疾病的分類診斷和個體化治療策略的制定。但總的來說，單細胞基因組學正在高速的發展著，為科學研究和臨床治療有力的支撐。

原文鏈接：

https://science.sciencemag.org/content/365/6460/1401

製版人：珂

參考文獻

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關鍵字: 基因組學 腫瘤 生物技術