摘要
現如今，基於細胞的免疫療法已經在臨床上取得了重大進展，並進入了推向市場的階段。包括CAR-T、工程化造血幹細胞移植和其他有前景的細胞療法在內，大量的臨床數據集都在增加。因此，為了滿足臨床和最終商業化規模生產細胞的需求，強調生物製造是相當必要的。
而強大的基礎設施應該能夠解決目前在細胞收集、擴增、操作、純化、保存和配製方面的侷限性，最終向患者提供可接受的成本治療方案。在今天的這篇綜述中，我們重點介紹了前沿生物工藝技術的案例，這些技術能夠提高即將進入臨床應用的細胞療法的生物製造效率。
1. 目標藥品的質量概況QTPP
2. 大規模製造的貼壁細胞擴增
3. 高通量細胞分選
4. CAR-T細胞和造血幹細胞的生產
5. 降低細胞生產製造成本
6. 細胞儲存和供應鏈管理
鑑於篇幅較長，小編將文章分成了兩部分：今天主要闡述的包括目標藥品的質量概況QTPP、大規模製造的貼壁細胞擴增以及高通量細胞分選。後續內容還請大家持續關注醫麥客平臺。
重要部分
細胞療法是一種基於人類細胞的“活藥物”，承諾改變包括癌症、神經退行性疾病和自體免疫性疾病等在內的治療方法。
學術界和工業研究的開發工作通常集中在理解細胞療法如何治療一系列不同的適應症上，正如最近I-III期臨床試驗的興起就突出了這一點(圖1a)。在半定量分析的基礎上，從III期研究到監管批准的細胞治療轉化率約為14.3％，遠低於成熟藥物類別的轉化率48.7％。(補充表1)。
隨著監管機構批准進行更多的研究，諸如再生醫學聯盟等組織鼓勵進行未來市場分析，以進一步量化和跟蹤趨勢。最近美國和歐盟對GSK、Tigenix、Novartis和Kite(吉利德公司)的批准為更明確的成功標準帶來了新的熱情，這些標準有助於將更多細胞療法推向市場。
細胞療法的前景伴隨著可重複製造和同時向數千名患者提供治療的新挑戰。重要的是要認識到，足以在早期關鍵臨床研究中生產產品的方法可能並不能適應商業化規模。因此，除了目前臨床試驗的成功率之外，如果不在早期開發階段進行評估，對常見疾病中細胞治療的商業規模需求將阻礙CTP(細胞治療產品)的供應(圖1b)，而這種供需缺口最終將影響可能無法接受CTP(細胞治療產品)服務的患者。此外，所涉及的相關物流和經濟因素並非微不足道：物理空間、生產時間、人力資源、耗材、廢棄物的產生(環境影響)和其他直接成本， 所有這些因素必須納入製造業藍圖的長遠視角。
作為核心角色，細胞製造過程並不新鮮。例如，發酵過程建立基礎設施，以生產大批來自細菌和酵母細胞的化學產品。攪拌釜反應器、液相色譜系統和交叉過濾技術等工程工具在新生化產品的開發過程中都已成熟。然後將類似的工具用於生物製藥的開發；實際上，細胞現在可以通過工程化以產生純化的生物製劑，例如單克隆抗體。與使用細胞生產分子試劑不同，在細胞療法中，最終制造的產品是細胞本身。因此，
CTP(細胞治療產品)的生產需要額外的處理步驟，例如細胞篩選、純化、配製、保存和分配。這些過程對分子試劑生產所需的技術提出了不同的挑戰，特別是考慮到細胞需要進行修飾的次數。然而，過去的製造工具對於CTP(細胞治療產品)生物過程的開發仍然是有價值的，同時考慮到規模化和降低成本。生物製造代表了美國先進製造合作計劃的重要推動力。例如，過去幾十年來，血液製品和骨髓產品的處理為人類細胞療法的發展樹立了先例，併為需要滿足的基本質量規範奠定了基礎。因此，以前為藥物和分子生物學而建立的法規、標準和指導現在也可以用於細胞療法。雖然具體法規因地區而異，但每個法規都要求生物製造解決方案支持符合當前的藥品生產質量管理規範(GMPs)，以通過適當的設計、監控和控制生產過程和設施來確保人類使用的產品的質量和安全性。(補充表2)提供了美國和歐盟管轄區的監管參考摘要。日本已經建立了再生醫學監管框架，且該框架已被美國通過21世紀治癒法案部分採用，並通過新的再生醫學和高級治療指定加快監管審查，以解決產品開發問題。
評估CTP(細胞治療產品)製造的關鍵決策點是自體和同種異體細胞療法之間的區別。儘管它們具有相同的最終目標——生產高質量的細胞治療。但在製造方面，兩種方式之間存在明顯差異。自體療法具有相當大的額外後續挑戰，因為封閉分佈模型意味著無法創建廣泛分佈的產品庫存，將可變的患者衍生細胞回輸到體內需要穩健的過程以確保最終產品的一致性；
在給定個體化治療方式的情況下，每個CTP(細胞治療產品)也需要患者篩查和釋放測試。用於自體治療的自動化即時技術可以在醫院現場製備產品，然後需要醫療設備(510k US)分類。
目前的趨勢表明，自體療法通常以~1 l scale進行，而同種異體細胞療法的生物過程計劃以>100 l scale進行。同種異體療法需要包括對細胞庫的廣泛測試，但不需要對所有患者進行廣泛篩選以生產散裝材料。雖然批量生產可以通過規模經濟幫助降低成本，但是通常需要更大更昂貴的設備設施。經營一個生產基地以滿足即將到來的CTP(細胞治療產品)需求，必須在規定的時間內生產一定數量的產品，這就帶來了對間接成本的進一步關注，尤其是人員成本。
在這篇綜述中，我們討論了用於臨床先進細胞療法的細胞產品的製造，並強調了在實現商業生產可擴展性之前可能面臨問題的生物過程(圖1c)。我們首先描述當前對產品質量的理解。 然後，我們回顧了關鍵的生物過程，並突出了細胞擴增、細胞工程、細胞分化、細胞純化，細胞生物材料配方、細胞保存和細胞運輸的瓶頸。每個生物過程都作為案例研究提供，並與特定的細胞療法實例配對，選擇這些實例為實際應用提供背景。此外，我們還討論了可以維持或改善這些生物過程控制的新興工程解決方案。
目標藥品的質量概況QTPP
隨著先進的細胞療法的出現，需要一個產品開發和管理的監管框架。一個例子是人用藥品註冊技術要求國際協調會議(ICH)，該委員會通過設計建立了質量框架(ICH Q8 - 藥物開發，2009年8月)。目標藥品的質量概況(QTPP)通過生物過程工程師可以在特定階段的開發計劃中努力的指標來定義CTP(細胞治療產品)的關鍵屬性。(補充表3)提供了通常需要為CTP控制的屬性範圍的描述性摘要。
這些屬性構成了產品規範的基礎，這些規範是根據廣泛的分析方法來度量的(Publicly Available Specification(PAS)93：2011-用於臨床應用的人體細胞的表徵提供了全面的總結)。
然後可以開發和應用生物處理工程控制，以確保生產性能達到或超過這些規格的產品，同時認識到基於細胞的產品的固有複雜性、顯著的異質性和批次間差異。例如，這將需要創新的細胞處理解決方案，其適用於從一個階段到下一個階段細胞起始材料的可變輸入，並且產生具有抑制可變性的標準化輸出。
應該在CTP(細胞治療產品)開發的早期優先考慮效力，因為它最終證實了CTP的實用性。效力是做出關鍵決策的標準，包括產品批次放行、保質期、不同地址生產的產品之間的可比性，以及臨床準備的驗證。然而，由於CTP的許多複雜性質以及它們對作用機制和自然批次間變異性的瞭解不足，定義和測量的效力可能具有挑戰性。在理想的產品中，一系列因果關係研究將CTP的(預)臨床功效與其作用機制及其相關的可測量的生物活性聯繫起來，並與實驗室測量效力的定量分析相關聯。(補充表4)總結了針對一系列CTP追求的效力量化的示例性方法。
效力也與CTP(細胞治療產品)的組成直接相關，由一組質量屬性定義：純度和一致性。
其中一致性定義了’活性藥物成分’'，純度將CTP與任何非藥物細胞(被認為是雜質)區分開來。通常情況下，用每一種細胞類型的精確頻率來產生純細胞成分是不現實的。挑戰在於剖析不同細胞發揮的積極和消極作用。
例如，在使用嵌合抗原受體CAR-T細胞的免疫療法中，其中CD19-CAR-T細胞是活性劑(補充表4)，CD4 +細胞是CD3 + T細胞的子集，可以被認為是產品的一部分或雜質。分離、轉導和擴增T細胞的過程可能會導致組成T細胞的不可控的比例變化，因為從一個病人到另一個病人的比例變化，以及由於T細胞類型之間的可變擴展特性。增加對混合細胞成分的控制需要額外的製造步驟，導致產品成本的增加，然而為每一個單元操作設計創新的過程設計，能夠建立一個有利的成本效益權衡。
另外，量化與QTPP相關的產品屬性的測試方法也可能是工程挑戰。例如，體外效力生物測定可能需要開發以量化產物釋放的效力。此外，CTP必須經過認證，不含微生物和其他製造殘留物，如培養試劑。在這方面，正在探索通過對血液製品及其組成部分進行選擇性破壞來減少病原體的治療方法，例如快速和在線檢測方法和封閉的微流控系統以及其他固有地消除微生物汙染風險的技術。因此，需要工程解決方案來建立敏感、及時和經濟有效的測試方法，以反映CTPs的獨特性，同時提供始終如一地滿足關鍵質量屬性的穩健性。
大規模製造的貼壁細胞擴增
細胞療法有時可能是“質量效應”的結果，也就是說，體內再生或免疫過程所需的細胞需要大量存在。因此，通過增加病理狀態下的細胞數量，治療的平衡可以傾向於修復。在這些情況下，培養足夠數量的細胞對於遞送有效劑量是必不可少的。
細胞擴增方法可用於CTPs的分類；例如，懸浮培養與貼壁培養。其中懸浮培養以空間有效的形式具有高產量的益處。相反，當以商業規模開發時，傳統的貼壁細胞培養方法需要大量且在邏輯上不切實際的平面表面區域，以用於細胞的生長。間充質基質細胞(MSCs)是一種貼壁細胞療法。因為能夠在細胞輸注後釋放一系列營養因子， MSCs有望用於治療造血功能衰竭、移植物抗宿主病、以及胃腸道、皮膚、心臟、肺、肝和腎疾病損傷。鑑於其易於分離和相對低的免疫原性，同種異體MSC產品已進入臨床試驗的最後階段。現在對大規模生產的需求至關重要，因為單劑量在1-10百萬MSCs kg-1範圍內。傳統上，MSCs在二維(2D)表面上培養，例如燒瓶或多層細胞工廠(圖2a)，並且預計大規模運行的批量大約為100-500億個細胞；然而，2D方法難以按比例放大並且在商業規模上經濟有效地運行。很明顯，目前的二維培養系統不足以滿足未來商業可行性的需要；相反，需要可擴展的閉環和潛在的自動化技術。
例如，3D貼壁生物反應器Quantum Cell Expansion System(Terumo BCT)是符合GMP標準、一種功能上封閉的中空纖維系統，用於臨床上MSC的擴增。該系統可在2周內產生約1×10^8個細胞，從而滿足國際細胞療法學會定義MSC的最低標準。在撰寫本文時，FDA已批准一個初始系統用於早期試驗的臨床應用。
面對數千名患者，從粘附的2D培養過渡到粘附的3D培養是細胞商業化生產的最佳途徑。此外，還有一種選擇是使用微載體，即支持微粒基質，允許細胞在3D條件下擴增(圖2b)。 MSC粘附於微載體上並在攪拌槽生物反應器(體積為300ml至1000 l)中培養以進行大規模擴增。儘管微載體技術具有擴大規模的優勢，但在生物反應器培養環境的優化方面仍存在許多挑戰(圖2c和補充表4)；例如，提供代謝底物(氧氣)的需要對於商業上可行的製造是至關重要的。
實際上，在任何擴大規模的嘗試之前，人MSC低於理想的細胞密度和低的特定攝氧率是必須解決的問題。因此，生物反應器系統密切選擇和控制諸如溶解氧的過程參數的能力可用於改善產品質量並提高產量，而不是基本上不受控制的2D方法。由於溶解度有限，需要連續供應氧氣；然而，隨著細胞密度的增加，可能需要通過噴射來提供氧氣，通常用空氣噴射，這可以除去產生的二氧化碳。然而，噴射需要在介質中包含保護劑，最常見的是表面活性劑Pluronic F68，其可以誘導破壞性空化氣泡，導致細胞活力降低。
使用無血清介質是降低每劑商品成本的一個機會。與微載體相結合，無血清培養基可以增加產量，減少與血清培養基相關的可持續性風險。
使用GMP-ready技術和xeno-free培養基已經在微載體工藝開發方面取得了一些進展。例如，使用基於無孔塑料微載體的1升攪拌槽生物反應器(SoloHill Engineering)培養7天后產生1.1×10^8骨髓間充質幹細胞(BM-MSC)和4.5×10^7脂肪組織間充質幹細胞(AT-MSC)。
最近，使用合成微載體(Synthemax-II microcarriers)和xeno-free培養基與靜態培養物和旋轉瓶的2升一次性生物反應器的比較顯示了生物反應器的可擴展性優勢。使用塑料微載體在攪拌罐5升生物反應器中生長12天的人BM-MSC保留了關鍵品質，在第8天和第12天細胞樣品中具有匹配的活細胞計數，這些研究累積地支持了放大比例的可行性。
微載體可以由不同的材料製成，支持不同的尺寸，呈現不同的孔隙率和不同的化學性質，因此可以針對特定的細胞生長條件進行優化。但選擇細胞生長的最佳條件並非易事，這往往是該技術的一個主要難點。材料科學的方法，如可生物降解的微載體或溫度敏感的微載體(圖2d)，將減少下游分開和分離方法的需要，分離出MSCs用於需要直接植入組織的臨床適應症，例如骨形成。
對於需要靜脈內施用MSC產品的臨床適應症，可以通過使用兩相液/液系統完全去除微載體以形成用於MSC擴增的臨時微載體表面。培養後，然後可以分散臨時微載體表面，產生液/液界面，收集MSC並且可以從中收集MSC作為單個細胞，而不需要酶溶液來分離MSC(在塑料微載體工藝中需要)。從生物反應器製造過程中去除微載體並減輕下游挑戰的另一種方法涉及通過形成球狀體來培養懸浮的MSC。這種擴增方法已證明改善了MSCs的臨界質量屬性和臨床前療效。
但是，與現有的貼壁擴增方法相比，還需要大力開發以保持MSC擴增潛力的水平。引入能夠給這些材料帶來工業穩健性的標準-科學解決方案將有助於建立高密度的MSC懸浮培養物，易於收集和分離，最終生產出高純度MSC產品。
高通量細胞分選
在細胞療法中，必須分離和富集具有最佳純度，通量和產量(相互依存的參數)的特定細胞群。細胞療法中的分離技術可以分為兩類：細胞-細胞分離，其目的是將一種細胞表型從另一種細胞表型中分離出來；和細胞-溶液分離，洗滌細胞群並更換培養基。細胞-細胞分離通常通過化學和機械方式實現，常見的方法包括Ficoll通過密度分離分離紅細胞、血小板和單核細胞，逆流離心淘洗根據大小和密度分離細胞，熒光激活或磁激活細胞分選(FACS或MACS)分離基於特定屬性的細胞。設備已經標準化了消除製造瓶頸的過程，特別是在自體細胞療法制劑中。
為了限制生物學變異，分離細胞群是細胞製造的關鍵步驟之一。例如，CD3 +白細胞必須從血液衍生物中純化，最常見的是通過血液成分分離程序。同時，去除非目標成分是非常重要的，如單核細胞、粒細胞、紅細胞和血小板，這些可能會對下游產生不利影響。
為了實現更高純度的產量交付，使用的最常見的富集方法是抗CD3塗覆的磁珠(圖3a)。這些珠子與靶細胞結合，然後通過將細胞懸浮液置於磁場中來純化。但這種方法通量低，需要昂貴的試劑，並且經常依賴於耗材唯一供應商(其承擔供應鏈風險)。另外，在體內使用磁性標記細胞存在一些安全問題，Dynabeads(免疫磁珠)要求接受的釋放標準為每3×10^6個細胞≤100個珠子。在研究新藥計劃(IND)下運作時，Miltenyi(美天旎)的CD34磁珠獲得了FDA的商業化使用許可。
已經商業化的產品還包括Quad Technologies的MagCloudz(圖3b)，其通過可溶解的抗體塗覆的水凝膠將磁珠與細胞進行物理分離，導致底物溶解後無珠子的下游產物。
FACS通常與結合熒光染料的抗體組合使用以標記細胞，並根據它們的激光觸發激發程度選擇它們(圖3c)。與MACS相比，FACS最適用於需要幾種標記來識別和純化CTP的情況。這在用於自身免疫疾病的人Treg細胞的純化中是必需的。
分離和擴增外周血T細胞，隨後使用一組抗體通過細胞外染色進行FACS分選，所述抗體識別具有CD4 + CD25HiCD127- / Low的表面標誌物表型的細胞。這種方法在臨床上被用於Treg細胞l純化，儘管在商業製造中維持這種工作流仍然是一個挑戰。許多用於無標記純化細胞的解決方案(圖3d)正在研究中，尤其是微流體技術與聲學、粒析或拉曼散射的結合使用。 其中SonoSep使用的是聲波分離技術，但到目前為止僅在實驗室規模上進行了演示。介電電泳已經顯示出基於膜電容分離細胞的希望，但目前只能以每小時150000個細胞運行，這表明個體患者的單採血液成分需要將近50小時才能完成。因此，儘管有大量技術進展，但仍然存在實現CTP可擴展性、質量和臨床實施安全性的挑戰。
4. CAR-T細胞和造血幹細胞的生產
5. 降低細胞生產製造成本
6. 細胞儲存和供應鏈管理
參考出處：
https://www.nature.com/articles/s41551-018-0246-6
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