魯鳳民1, 竇曉光2, 張文宏3, 王福生4
1 北京大學醫學部；
慢性乙型肝炎（CHB）及其所導致的肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌仍是嚴重威脅我國人群健康的重大疾病。共價閉合環狀DNA（cccDNA）的持續存在導致HBV感染慢性化，也是CHB久治不愈和停藥後容易復發的主要原因。因此，肝組織內檢測不到cccDNA被認為是判斷HBV感染徹底治癒的一項重要指標。然而，臨床上以cccDNA檢測為目的的肝穿刺活組織檢查難以普遍開展，除了有創性以外，cccDNA在肝臟中的分佈不均、鬆弛環狀DNA（rcDNA）對cccDNA檢測特異性的影響以及目前尚無經嚴格驗證和審批上市的cccDNA檢測試劑盒限制了其應用。因此，在無法直接精確檢測肝組織內cccDNA及其活性的情況下，探索能夠反映肝內cccDNA活性的替代檢測指標，並用來監測肝內cccDNA水平和轉錄活性具有十分重要的意義。血清標誌物易於獲得、可重複取樣，是臨床上最便於採集和動態觀察的檢測樣本。
對HBV感染複製過程的再認識，有助於篩選能夠反映cccDNA活性的病毒學指標
在HBV複製過程中，轉錄自cccDNA的3.5 kb前基因組RNA（pgRNA）與具有逆轉錄活性的HBV DNA聚合酶（p蛋白）結合形成複合物，招募HBcAg聚集形成核衣殼。在核衣殼內，首先以pgRNA為模板，p蛋白髮揮逆轉錄酶活性合成病毒的負鏈DNA，再以負鏈為模板合成出不完整的正鏈DNA；而pgRNA則被p蛋白的RNase H酶活性所降解。最終含有不完全開鏈環狀rcDNA的核衣殼經多囊泡小體釋放形成完整的子代病毒。然而，1996年德國學者在探究HBV能否成功感染人外周血單個核細胞時意外地發現，患者血清中還存在HBV RNA。
近年來，我國和國外學者相繼發現這些HBV RNA實質上可能就是核衣殼內未經逆轉錄的pgRNA。與已經完成rcDNA合成的成熟核衣殼一樣，這些含有未經逆轉錄pgRNA的核衣殼也可獲得病毒外膜，並以病毒樣顆粒形式釋放。包含有rcDNA或pgRNA的核衣殼在取得病毒外膜後形成實心病毒顆粒。但最新研究提示患者血清中也存在大量核衣殼內不含任何病毒核酸的空心病毒樣顆粒（圖1）。HBV RNA病毒樣顆粒也帶有由HBsAg組成的病毒外膜，因此理論上講HBV RNA病毒樣顆粒可以像丁型肝炎病毒那樣具有感染性。但筆者最近在抗病毒治療阻斷高病毒載量孕婦母嬰傳播的隊列研究中發現，在核苷和核苷酸類藥物（NAs）的作用下，這些HBV RNA病毒樣顆粒往往不具有感染性。
圖1 HBV感染複製週期示意圖
圖1顯示3.5 kb preC/pgRNA轉錄體只能來自cccDNA。其中preC RNA編碼HBeAg，pgRNA則既是子代病毒rcDNA逆轉錄合成的模板，也是HBcAg和病毒p蛋白的信使RNA。HBeAg和HBcAg均來自cccDNA，能夠在一定程度上反映cccDNA的存在和轉錄活性。由於二者氨基酸序列有較多的重疊難以區分，有學者研製了能夠同時定量檢測血清HBeAg和HBcAg的核心抗原相關抗原(HBcrAg)試劑，目前這一新的病毒學指標的臨床意義正逐步獲得重視。
血清HBV DNA及HBsAg檢測用於評價NAs治療均有一定的侷限性
既往研究表明，血清HBV DNA和HBsAg水平均與肝組織內cccDNA的活性呈正相關，其中血清HBV DNA是被廣泛用於判斷患者病毒學應答、療效觀察及鞏固治療後停藥的重要標識。持續病毒學應答的定義為：停藥後HBV DNA 持續低於高敏檢測試劑的檢測下限。然而，在NAs抗病毒治療的情況下，血清HBV DNA消失可能並不代表肝組織內cccDNA被清除或處於轉錄沉默狀態。這也解釋了即使按現行指南在鞏固治療後才停藥，仍有非常高的病毒學反彈和疾病複發率。
同樣，血清HBsAg水平是被廣泛用作判定CHB抗病毒治療應答的重要指標。血清學HBsAg消失更被廣泛認為是理想的臨床抗病毒治療終點，並將HBsAg消失（伴有或不伴有血清學轉換）定義為“功能性治癒”，國內稱之為“臨床治癒”。但是，由於HBsAg既可來源於cccDNA，也可來源於整合的HBV DNA片段，故即使經長時間NAs抗病毒治療能夠使肝組織內cccDNA幾近耗竭或轉錄活性幾近沉默，血清HBsAg仍然可能持續陽性。因此，將血清HBsAg持續消失作為功能性治癒或臨床治癒的判定標準，可能會使一些患者繼續接受不必要的抗病毒治療。因此，臨床上亟需能夠更好地反映cccDNA存在和轉錄活性的替代指標。
血清HBV RNA水平能夠較好地反映肝組織內cccDNA的活性
近期的一些動物實驗和臨床隊列研究結果均表明，在HBeAg陽性的慢性HBV感染者中，血清HBV RNA與肝組織內cccDNA水平呈正相關，而這種相關性在HBeAg陰性慢性HBV感染者中往往消失。筆者研究顯示，在未經治療的HBeAg陰性慢性HBV感染者中，HBV聚合酶RT區的突變可能是血清HBV RNA水平與肝組織內cccDNA水平相關性消失的原因之一。雖然在經過NAs治療的慢性乙型肝炎患者中，血清HBV RNA定量不再能夠反映肝組織內cccDNA的水平，但卻能定性反映肝組織內的cccDNA是否有轉錄活性。因此，血清HBV RNA有可能被用作預測NAs停藥安全性的候選指標。此外，張文宏教授團隊近期發表的一項研究還顯示，在接受NAs治療患者中，雖然HBV DNA已經降低至不可測的水平，但這些患者的肝臟組織學仍然有炎症和纖維化的表現；進一步分析發現，血清HBV RNA水平與肝臟炎症程度評分（r=0.665, P＜0.001）及纖維化程度評分（r=0.722，P＜0.001）均明顯相關。
血清HBV RNA在CHB抗病毒治療進階式“治癒”各階段的應用展望
如果按現行指南建議在鞏固治療後停藥，儘管仍有較高比例的停藥後反彈和復發，但約50%的HBeAg陽性患者和30%的HBeAg陰性患者，在停藥滿3年時仍能維持病毒學應答。鑑於血清HBV RNA能夠較好地反映肝組織cccDNA的活性，如果在停藥前通過檢測血清中的HBV RNA水平對患者的復發風險進行預判，將有助於甄別出那些已經達到病毒學應答並且在停藥後能夠維持病毒學應答的“部分治癒”的患者，從而實現安全停藥。另外，越來越多的臨床治療研究顯示，處於HBsAg低值陽性這一“準臨床治癒” 階段的患者，在接受了有限療程的長效干擾素等治療後發生血清HBsAg陰轉的比例較高。據此，對長期接受NAs治療但血清HBsAg仍然低值陽性的患者，筆者提出了基於血清HBV RNA檢測是否陽性，分別採取換用或加用長效干擾素治療、以追求更高“臨床治癒”率的精準治療路徑的建議。
CHB的治癒存在3個需要克服的障礙：病毒在體內持續存在、肝臟病理學異常（肝臟炎症壞死、纖維化等）和機體抗HBV的免疫反應紊亂。王福生等提出了“爬坡”理論，即在抗病毒治療基礎上聯合有效的免疫調節治療，幫助患者恢復抗病毒免疫應答，以最終達到持久清除病毒、恢復機體保護性免疫的目的。“完全治癒”指通過治療“使體內沒有任何病毒殘留、機體恢復到與從未感染人群一樣的狀態和預期壽命”。目前多數學者認為，這一終極的“完全治癒”既幾乎不可能達到，也無法通過實驗室手段鑑別是否達到。為此，筆者提出了從“部分治癒”、“準臨床治癒”、再到“臨床治癒”（或“功能性治癒”）的階梯性提升模式（圖2）。筆者希望，以cccDNA消失或靜默為基礎、以HBV DNA和HBV RNA持續陰性為依據的“部分治癒”能夠預測NAs停藥後復發或病毒學反彈風險；在此基礎上的以血清HBsAg低水平為標準的“準臨床治癒”，能為更多的CHB患者帶來戰勝乙型肝炎的希望。最後，需要特別強調的是，血清HBV RNA檢測的臨床意義仍需要大規模的臨床研究進行驗證，更需要在未來可能的真實世界的應用中不斷完善。
圖2 NAs鞏固治療後，基於HBV RNA檢測的慢性乙型肝炎抗病毒治療階梯式“治癒”建議
關於重新定義“病毒學應答”概念的建議和基於HBV RNA檢測的停藥風險預測建議
在NAs的抗病毒作用下，血清HBV DNA的消失僅能代表病毒的逆轉錄過程被有效抑制，並不能真實反映肝細胞內cccDNA的轉錄活性狀態。而HBV RNA病毒樣顆粒的發現讓筆者意識到，在NAs阻斷逆轉錄過程後，存在於核衣殼內的pgRNA不再能有效地轉換成rcDNA，轉而以HBV RNA病毒樣顆粒的方式釋放進入血液循環。由於整合的HBV基因組最長也不會超過雙鏈線性DNA的全長（~3.2 kb），故3.5 kb長的pgRNA只能由cccDNA直接轉錄產生。相比血清HBsAg水平，血清HBV RNA能夠更好地反映肝組織cccDNA的活性。我國幾個團隊通過合作研究發現，接受NAs治療的CHB患者停藥時血清HBV RNA水平與停藥後病毒學反彈發生率密切相關，即停藥時血清未檢出HBV RNA的患者發生反彈的風險顯著降低。
據此，筆者提出了“安全停藥”的建議，即對鞏固治療後達到現指南停藥標準的患者加測血清HBV RNA，對那些持續陰性的患者可以考慮嘗試停藥。筆者倡議，對於這一依據小樣本回顧性研究發現的新指標，應進一步開展多中心、前瞻性、大樣本隊列研究，以驗證其預測停藥後病毒學復發及臨床復發的能力。
引證本文：魯鳳民, 竇曉光, 張文宏, 等. 慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA檢測的臨床意義[J]. 臨床肝膽病雜誌, 2018, 34(5): 934-938.
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