雖然糞菌移植（FMT）為一些疾病的治療帶來了新希望，讓我們看到了操縱微生物組的前景，但同時也讓我們意識到當中的風險。
而為了規避這種風險，許多科學家開始嘗試對微生物進行精確編輯。那麼目前有哪些編輯手段與方法呢？
今天我們特別編譯了近期發表在 PNAS雜誌上的News Feature: Editing the microbiome一文，以介紹當前微生物組編輯的現狀與進展。同時，希望通過該文為各位產業人士和讀者帶來一些啟發與提示。
新時代：合理設計微生物組
把一隻肥胖老鼠體內的微生物移植到另一隻瘦骨嶙峋的老鼠體內，即使不改變飲食、活動和其他生活習慣，瘦老鼠的體重也會增加[1]。這些研究越來越清楚地表明，有機體內的共生微生物可以對宿主（包括人類）的健康產生重大的影響。
過去十年來的研究工作表明，我們體內的微生物能促進大腦發育、刺激免疫系統發育或者引起過敏[2]，並可能會誘發某些癌症。這些發現催生了益生菌、益生元、個人微生物組測序等產業。
但是，很少有治療方法能夠真正改變——更不用說改善——我們的共生菌群。部分原因在於對這些微生物動態變化的觀察，離我們充分了解它們的運行機制並實現有效和安全的干預，還差一步。
糞菌移植（FMT）已經證實了操縱微生物組的前景和風險。對於那些正在反覆與艱難梭狀芽胞桿菌感染作鬥爭的絕望的病人來說，從一個健康人的腸道移植全部細菌到另一個病人的腸道，即可緩解相關症狀[3]。
然而，即使 FMT 起作用，我們也沒有辦法對其效果進行標準化或者量化。
最近的幾起由 FMT 引起的嚴重副作用的案例（包括一例死亡），導致 FDA 暫停了所有 FMT 的臨床試驗。該舉措將一直持續到有新增的安全措施部署到位[4]。
“我們真的不知道 FMT 可能導致的長期後果，” 北卡羅來納州立大學的微生物學家 Casey Theriot 說，“它的確可以挽救生命，但是我們並不想利用它解決所有問題。我們需要更加明確的細菌療法。”
Theriot 和其他公司正致力於研究靶向療法和開發用於精確編輯微生物的工具，以實現治療疾病的目的。
基於對內部生態系統如何在特定情況下運作、改變和控制我們的健康等問題的理解，研究人員們已可以在不破壞更大的微生物群落的情況下，去除病原體或增強代謝功能。
“在過去的幾年裡，情況發生了巨大變化。我們已從簡單地觀察健康和疾病個體中的微生物，進步到可將它們與宿主體內的生物活動聯繫起來。”斯坦福大學的微生物學家 Justin Sonnenburg 說。
Sonnenburg 表示：“這是向‘理解微生物功能’的過渡，它將引領我們進入一個‘合理設計微生物組’的時代。”
掃描電子顯微照片：艱難梭狀芽胞桿菌 圖片來源:ScienceSource/Paul Gunning
鎖定單個物種
對於因其他疾病而住院的病人來說，感染艱難梭菌是一件很令人頭疼的事情。但它對於研究人員來說，卻極具吸引力。因為我們已經知曉病原體與共生微生物及腸道環境之間如何發生互作。
“我們清楚地知道，在這些感染髮生後，應該去做些什麼。” Theriot 說，“微生物組、代謝物和艱難梭菌感染之間，究竟發生什麼聯繫，這已經很清楚。”
在一個健康的腸道中，共生梭狀芽胞桿菌和其他種類的細菌，會阻止艱難梭菌的增殖。在一定程度上，這是通過競爭病原體所需的共同營養物質來實現的。
但是抗生素會殺死這些共生菌，如果沒有這些有益微生物及其產生的化學信號，艱難梭菌就會對腸道造成嚴重的感染[5]。
患者此時會出現腹瀉、噁心和腹痛，而醫生會再次給他們開具抗生素以治療這些症狀。這些藥物可治癒大多數艱難梭菌感染患者的感染，但至少有 30%的患者會出現病情惡化。由於致病的艱難梭菌比其它共生菌恢復得更快，這就需要再使用一輪抗生素治療[6]。
這種再度感染的循環往復會持續數年，這也是為什麼絕望的病人們會採取一些極端的措施，比如自己動手去做 FMT。
Theriot 和她的團隊希望通過不抑制共生細菌的方法來治療艱難梭菌，因此研究人員們將注意力轉向了一種工程噬菌體。
這種噬菌體是由位於北卡羅來納州莫里斯維爾的初創公司 Locus Biosciences 生產的，該噬菌體可特異結合到某些細菌種類上。
先前的研究表明，噬菌體的使用可能是治療艱難梭菌感染復發的有效策略[7]。
該公司設計了特異針對艱難梭菌的噬菌體，讓它們在自己的基因組中攜帶並編碼一種名為 CRISPR-Cas3 的基因編輯系統的 DNA 序列。該公司的科學顧問 Theriot 說，Cas3 酶“像吃豆人咀嚼 DNA 一樣”，切割整個目標細菌的基因組。
在未發表的研究中，Theriot 的團隊發現，在實驗中，對感染艱難梭菌的小鼠，持續 3 天每天 2 次投餵包含 cas3 的噬菌體，可以減少疾病的臨床症狀，如水腫、體重減輕和腸上皮表面損傷，同時病原體的水平也會顯著降低。
Theriot 表示，這項工作初步證明了該策略的可行性。
這種策略相當於對細菌發起直接攻擊，而另外一種方法是改變目標病原體賴以生存的微環境使其變得不適宜生存。
加州大學戴維斯分校的微生物學家 Andreas Bäumler 的切入點是抗生素導致人體細胞的代謝紊亂。他的想法是，嘗試降低環境對碳青黴烯耐藥性腸桿菌（如肺炎克雷伯菌和大腸桿菌）的友好性，而這些細菌也正是那些孱弱的住院病人們面臨的主要感染威脅。
破壞腸道菌群的藥物，會使微生物和人體細胞之間發生的化學反應消失一半。在這種情況下, 腸上皮細胞開始產生更多的氧氣和硝酸鹽，而這恰恰是碳青黴烯耐藥性腸桿菌定殖生長所需的環境[8]。
由於患者有可能仍在服用抗生素, 所以利用益生菌來促進恢復完整健康的微生物組並不可行, 原因在於這些益生菌同樣對抗生素很敏感。
因此，Bäumler 和他的同事們試圖通過重新引入缺失的、能指導腸道細胞活性的微生物，來恢復健康微生物環境所必需的關鍵因子。
他們的團隊使用了一種“仿生學”藥物（一種叫做 5-氨基水楊酸的常用藥物）。該藥物已經與大腸桿菌屬的一種益生菌菌株聯合使用，以用於治療炎症性腸病。
他們發現，藥物與益生菌聯合使用的方法，可以保護模型動物免受碳青黴烯耐藥性腸桿菌的侵襲。Bäumler 的實驗室前博士後 Erin Olsan 在舊金山舉行的美國微生物學會年會上表示，這種治療方案起到了與完整的 FMT 同樣的效果[9]。
Bäumler 將這些細菌感染與尋找治療方法時遇到的挑戰，比作“搶椅子游戲”。
當我們的微生物群落建立時，我們的飲食、免疫系統和許多其他因素，共同決定了大腸內微生物的飲食選擇，從而決定了哪些共生菌將會“吃得好”並能夠在我們的腸道內繁衍生息。
在一個健康、成熟的腸道生態系統中，餐桌上的每個地方都坐得滿滿的，沒有地方留給病原體。這種所謂的定殖抗性，使健康的微生物群“抗拒改變”，同時也為開發具有持久效果的治療方案帶來了許多困難。
而在患者或服用抗生素的人的微生物組中，許多“就餐者”被從他們通常佔據的位置上趕了下來。
Bäumler 說，使用仿生學藥物或腸道菌群產生的小分子，就好比把一件夾克放在椅子上，然後聲稱這就是自己的地盤。
雖然這些方法被證明對艱難梭菌或碳青黴烯類耐藥腸桿菌等具體的目標是行之有效的，但是在治療其他疾病時，這些方法可能就變得“捉襟見肘”了。
“這個問題經常出現，因為在炎症性腸病、肥胖症或結腸癌等疾病中，我們不知道哪些微生物是重要的。” Theriot 說。
掃描電子顯微照片：肺炎克雷伯菌 圖片來源: Flickr/NIAID
將“罪魁禍首”鎖定到單一細菌物種，幾乎是不可能的，但這也可能是不必要的。
“‘一次一個漏洞’的研究策略，有助於我們理解細菌的生理功能,” 紐約哥倫比亞大學的 Harris Wang 說，“但在複雜的群落環境中，你可能永遠無法以這種方式把問題分解成單個元素。”
他說，要使這一領域取得進展，研究人員必須在整個群落層面上進行研究和實驗操作，而不僅僅是在實驗室培養的單個菌株上。
他解釋說，要了解某種基因或代謝功能是否有助於某種微生物在腸道中定殖，最可靠的方法就是移除該基因或代謝途徑，並測試移除後該細菌在腸道中的定殖能力。
他說，Harris Wang 的研究正是基於這樣一種需求所開展開發出的工具，以實現對微生物群落的精確操縱：既可添加功能，也可移除功能。
Harris Wang 的團隊的目標是進行他所謂的“微生物基因治療”，即將選定的基因和信號通路傳遞到一個已建立的原生微生物群落中，然後該群落就可以保存這些獲得性能力，並隨著時間的推移穩定地傳播它們。
為此，他的團隊將研究重點放在被稱作質粒的可移動 DNA 片段上，細菌可以複製這些質粒並將其傳遞給鄰近的細胞，而它們本身或受體細胞的染色體並不會被改變。與噬菌體（擁有非常特定的宿主）不同的是，質粒可以被調整使其可集體傳遞或者只傳遞給特定的宿主。
在最近的一項研究中，研究小組改造了大腸桿菌，使其攜帶一種廣譜的宿主質粒，可以在相互接觸的細菌之間傳遞。他們利用一種基因來產生熒光標記，發現用這種大腸桿菌菌株處理過的小鼠腸道細菌也攜帶了這種標記，並且這種標記廣泛存在於多種共生物種中[10]。
原則上，這項技術可以被用於向細菌中添加編碼代謝毒素或特定營養素的基因。即使改造過的大腸桿菌因為“無法在餐桌上找到位置”而無法在腸道中定植，它們所攜帶的質粒也應該能在腸道中的原生細菌物種中維持下去。
另一種增加功能並確保它們能穩定傳遞下去的策略是在晚餐菜單上為被改造的微生物添加一道“特殊的菜”。
去年，Sonnenburg 的團隊發表了一項研究，闡明瞭擬桿菌屬（美國成年人腸道中含量最多的細菌）是如何被調節來消化飲食中草酸鹽的機理。
這些化學物質通常存在於西紅柿、綠葉蔬菜、黑巧克力和其他的一些食物中。雖然富含草酸鹽的食物對於大多數人來說是無害的，但它卻會引起有腎結石病史的人舊病復發。
Sonnenburg 和他的同事們對擬桿菌進行了改造，使其攜帶編碼草酸降解酶的基因。他們還添加了消化卟啉的基因。
卟啉是一種來自於可食用海藻的糖類物質，雖然它在西方標準飲食中並不常見，但它卻是一種工程化微生物存活所必需的控制分子。
當老鼠被餵食這種多糖，然後用改造後的細菌進行感染後，該細菌便在小鼠腸道微生物群落中擁有了一個特殊的生態位[11]。
“它使細菌能夠獨立於背景菌群工作，並達到高水平的可繁殖定殖，” Sonnenburg 說，“人們通常很難控制自己的飲食。所以這裡的想法是，如果你的腸道里有這種治療性微生物，你就無需費那麼大力氣在飲食中迴避草酸鹽了。”
類似地，對特定宿主微生物群落中的原生微生物進行工程改造，可能有助於確保它們在已經成功佔據的生態位中生存下來。
加州大學聖迭戈分校的 Amir Zarrinpar 研究的是原生微生物群落中常見的微生物。他之所以選擇該方向，其中的部分原因源自一個偶然的發現。
他的團隊一直在研究大腸桿菌 Nissle，這是一種常見的實驗室菌株，目前其他研究人員也正在探索它的治療用途。但 Amir Zarrinpar 和他的團隊發現，攜帶質粒的 Nissle 細菌在動物體內無法很好地繁殖。
在做相關實驗時，Zarrinpar 實驗室的前博士後 Steven Brown 發現另外一種大腸桿菌菌株（一種原生於老鼠腸道的菌株）似乎作用效果更好。他們將帶有熒光標記的質粒導入原生微生物，該改造後的原生菌株便能更好的在老鼠腸道定殖[12]。
如果這種菌株改造後能攜帶編碼特定代謝功能的基因，理論上講,它可以重新整合到腸道微生物群落中並長久維持下去，並且不需要額外的營養物質，比如卟啉。
“改造原生細菌並不簡單，因為它們有先天的防禦機制來阻止自身的 DNA 被操縱，” Zarrinpar 說，“但如果我們對這些特徵進行很好的研究，我們就可以利用它們來保護我們插入到細菌中的這些 DNA。”
他說，原生細菌的另一個優點是，它們可以用於人體的特定部位：寄生在上結腸粘液層的細菌與那些生活在被稱為隱窩，也就是腸摺疊深處的細菌是不同的。
因此，只需要簡單地選擇合適的菌株，便可將某項功能傳遞到身體的任意特定部位。
Zarrinpar 說：“更好地去研究原生細菌是非常有意義的，因為它們能夠成為強大的載體。”
目前，這些研究主要是為某些原理尋找證據：使用像 GFP 這樣的基因來編碼生成熒光標記，進而顯示這種方法是否有效。
“下一個巨大的挑戰，是如何去證明我們可以在功能上操縱微生物群落，” Zarrinpar 補充道，“其次，是我們如何實現並控制對上述操作，使其作用於人類。”
微生物組療法的未來沒有微生物
最終，這些編輯微生物群落的方法不僅可以用來開發新的治療方案，還可以用來建立追蹤微生物新陳代謝的傳感器。作為研究工具，它們將繼續拓寬研究人員們對微生物促進人類健康和誘發疾病的機理的理解。
當前，一些發源於實驗室的初創公司，已開始將一些微生物組編輯技術應用到臨床研究，目前已有幾個項目處於第一階段的臨床試驗。
Locus Biosciences 開發的包含 cas3 的噬菌體正在進行應對艱難梭菌、尿路大腸桿菌以及其他細菌感染的測試工作。
位於美國馬薩諸塞州劍橋市的 Synlogic 公司測試了幾株共生大腸桿菌，這些大腸桿菌改造後攜帶填補代謝途徑缺陷的基因，比如苯丙酮尿症(一種遺傳病，患者缺乏降解某些氨基酸的酶)。他們開發的 SYNB1618 菌株可以在小腸中降解苯丙氨酸[13]。
總部位於美國加州舊金山的 SioltaTherapeutics 公司正在動物模型中測試一種可減少過敏反應（比如哮喘）的混合細菌[14]。
不斷遇到的挑戰和懸而未決的問題，肯定仍然存在。
治療策略將需要克服原生微生物對“新居民”的抵抗力，不管這種抵抗力是暫時存在的還是永久持續的。
那些試圖改造原生細菌的人們需要找到合適的遺傳工具和適宜的細菌生長條件，因為它們中間有許多從未在實驗室實驗中被培養或改造過的細菌物種。
在插入質粒等 DNA 片段時，研究人員需要學習如何控制這些移動因子在野外環境中的擴散。
也許最重要的是，研究結果並不總是從老鼠身上轉化到人類身上，甚至也不總是從早期的人類研究轉化到後期的人類研究上。
Zarrinpar 說，最理想的情況是，研究人員們將利用這些工具徹底擺脫對微生物的使用。經過對微生物群活動的多年觀察，以及從事合理的細菌設計的相關經驗，研究人員將有能力鑑定出模擬或更好呈現微生物功能的小分子或療法。
“完美的微生物組療法不會使用微生物組，”他說。“取而代之的是，我們將找到微生物組影響人體生理變化的‘作用槓桿’，然後我們自己就可以直接對這些槓桿起作用，而不再依賴於細菌。”
參考文獻：
1.V. K.Ridaura et al., Gut microbiota from twins discordant for obesity modulatemetabolism in mice. Science 341, 1241214 (2013).
2.E. M.Brown, D. J. Kenny, R. J. Xavier, Gut microbiota regulation of T cells duringinflammation and autoimmunity. Annu. Rev. Immunol. 37, 599–624 (2019).
3.I.Youngster et al., Oral, frozen fecal microbiota transplant (FMT) capsules forrecurrent Clostridium difficile infection. BMC Med. 14, 134 (2016).
4.U.S.Food and Drug Administration (2019). Important safety alert regarding use offecal microbiota for transplantation and risk of serious adverse reactions dueto transmission of multi-drug resistant organisms.https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/safety-availability-biologics/important-safety-alert-regarding-use-fecal-microbiota-transplantation-and-risk-serious-adverse.Accessed 14 January 2020.
5.M. C.Abt, P. T. McKenney, E. G. Pamer, Clostridium difficile colitis: Pathogenesisand host defence. Nat. Rev. Microbiol. 14, 609–620 (2016).
6.S.Bibbò et al., Role of microbiota and innate immunity in recurrent Clostridiumdifficile infection. J. Immunol. Res. 2014, 462740 (2014).
7.J. Y.Nale, T. A. Redgwell, A. Millard, M. R. J. Clokie, Efficacy of an optimisedbacteriophage cocktail to clear Clostridium difficile in a batch fermentationmodel. Antibiotics (Basel) 7, 13 (2018).
8.S. E.Winter et al., Host-derived nitrate boosts growth of E. coli in the inflamedgut. Science 339, 708–711 (2013).
9.E. E.Olsan, D. N. Bronner, C. Tiffany, E. Velazquez, A. J. Bäumler (2019).Development of faux-biotics to prevent CRE colonization after antibiotictreatment. ASM Microbe 2019, June 20–24, San Francisco, CA.https://www.abstractsonline.com/pp8/-!/7859/presentation/17292. Accessed 12November 2019.
10.C.Ronda, S. P. Chen, V. Cabral, S. J. Yaung, H. H. Wang, Metagenomic engineeringof the mammalian gut microbiome in situ. Nat. Methods 16, 167–170 (2019).
11.E. S.Shepherd, W. C. DeLoache, K. M. Pruss, W. R. Whitaker, J. L. Sonnenburg, Anexclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota.Nature 557, 434–438 (2018).
12.S. D.Brown, B. J. Russell, A. Zarrinpar (2019). Function delivery to theconventional mouse gut using native E. coli by stable maintenance of arecombinant plasmid. ASM Microbe 2019, June 20–24, San Francisco, CA.https://www.abstractsonline.com/pp8/#!/7859/presentation/17132. Accessed 12November 2019.
13.V. M.Isabella et al., Development of a synthetic live bacterial therapeutic for thehuman metabolic disease phenylketonuria. Nat. Biotechnol. 36, 857–864 (2018).
14.B. M.Fiebiger, R. B. Valladares, S. V. Lynch, N. E. Kimes, A live microbialbiotherapeutic product for induction of allergy-protective immunity. J. AllergyClin. Imunol. 143, AB68 (2019).
原文鏈接：
Madhusoodanan, Jyoti. "News Feature: Editing themicrobiome." Proceedings of the National Academy of Sciences 117.7 (2020):3345-3348.
https://www.pnas.org/content/117/7/3345?ct
作者｜Jyoti Madhusoodanan
編譯｜朱國利
審校｜617
閱讀更多 熱心腸先生 的文章
