鄭樂民
北京大學心血管研究所副所長、熱心腸智庫專家
2 月 25 日，Gastroenterology 雜誌上線了北京大學鄭樂民教授及其團隊的最新研究論文。我們在昨天的熱心腸日報進行了解讀：
北大鄭樂民團隊突破：全新的促脂肪肝腸道菌群代謝產物！
Gastroenterology——[IF:19.233]
① 腸道菌群代謝物N,N,N-三甲基-5-氨基戊酸（TMAVA）及其前體三甲基賴氨酸（TML），在脂肪肝患者血液中升高；② 糞腸球菌和銅綠假單胞菌可將TML代謝為TMAVA；③ 小鼠TMAVA處理可加重高脂餵養誘導的脂肪肝、引起菌群失調和不耐寒；④ TMAVA可結合並抑制γ-丁酰甜菜鹼羥化酶（BBOX）抑制內源性肉鹼合成，使小鼠體內肉鹼水平降低，導致肝臟線粒體脂肪酸氧化減少，同時脂肪組織脂解增多，引起遊離脂肪酸在肝臟積累；⑤ BBOX敲除小鼠在高脂餵養下同樣出現體內肉鹼缺乏、脂肪肝；⑥ 外源性補充肉鹼可逆轉TMAVA誘導的小鼠肝臟脂肪病變。
TMAVA, a Metabolite of Intestinal Microbes, Is Increased in Plasma From Patients With Liver Steatosis, Inhibits γ-butyrobetaine Hydroxylase, and Exacerbates Fatty Liver in Mice
02-25, doi: 10.1053/j.gastro.2020.02.033
【主編評語】腸道菌群可影響非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的發生和發展，但其背後的機制（特別是菌群代謝產物在其中的作用）仍需深入揭示。Gastroenterology最新發表了來自北京大學鄭樂民團隊的研究，通過隊列研究和小鼠試驗發現，一種新的腸道菌群代謝產物TMAVA（N,N,N-三甲基-5-氨基戊酸）能通過影響肉鹼合成和後續的脂肪酸氧化，來加重脂肪肝。這些發現為腸道菌群如何影響脂肪肝發生提供了一種新機制，也提示補充肉鹼和靶向調節菌群或是治療脂肪肝的新思路。（@mildbreeze）
今天，我們特別編髮對鄭樂民教授的書面專訪。
專訪中，我們請鄭老師對該研究的背後故事、研究意義、未來應用以及研究經驗等做了解讀與分享。
以下是專訪內容：
① 祝賀鄭老師和團隊發表重磅新研究，首次發現了一種能加重脂肪肝的新型腸道菌群代謝產物 TMAVA。能否請您簡單介紹一下這個項目的由來，以及團隊成員和大家在這項研究中的分工？
這個項目在 2014 年就開始進行了，因為我之前的研究主要集中在脂蛋白代謝——採用蛋白組學研究高密度脂蛋白的修飾和功能改變。14 年時我們想進軍代謝領域，重點用代謝組學檢測疾病中代謝物質的改變，在動物實驗中研究機制。
TMAO 的故事提供了一個很好的研究範例。另外，由於我的博士是在 Cleveland Clinic（克利夫蘭醫學中心）讀的，導師是 Stanley L.Hazen，在14 年時我們就快速建立起 TMAO 代謝通路的質譜檢測方法，所以想是否可以按照 TMAO 的發現過程嘗試新的菌群代謝物的尋找。
我們初期先用 15 例正常人和 15 例非酒精性脂肪肝患者進行了非靶向代謝組學的檢測。
因為非靶向代謝組學沒有完善的數據庫，並且在 14 年的時候數據庫相比現在更不完善，所以非靶向代謝組學一個關鍵難點是質譜檢測出來的 m/z 很難確定是什麼具體的代謝物。
我們根據質譜 raw data（原始數據）首先去確定每個 m/z 的峰形、積峰定量是否準確，在峰形和積峰定量準確的情況下，分析哪些 m/z 發生了改變。
我們看到很多 m/z 都發生了改變，其中有個物質（暫時命名為 “81”）的代謝譜圖吸引了我們的注意，因為這個物質在質譜中有個離子碎片的 m/z 是 60.08。
研究 TMAO 的科研者都知道，60.08 是三甲胺基團的分子量，已經發現有重要功能的肉鹼（carnitine），膽鹼（choline），甜菜鹼（betaine）和丁基甜菜鹼（butyrobetaine）都有這個特徵碎裂片段。
我們當時覺得這個物質可能類似已經報導的物質，和腸道菌群代謝相關，是 TMAO 的上游，比較類似 2014 年發表在 Cell Metabolism 上丁基甜菜鹼的研究（Koeth et al., 2014）。
於是我們就嘗試性地給小鼠進行四聯抗生素干預發現，抗生素干預 4 周後 “81” 的水平果然和 TMAO 同樣降得很低，我們就覺得這個物質可能比較重要。
不過在此時我們還沒有確定這個物質的具體結構，我們只知道這個物質的碎片離子，所以下一步的重要工作就是確定“81”的具體結構。
這也有賴於我本科是化學專業和北大強大的多學科優勢，諮詢了很多化學合成的朋友，最後在北醫藥學院孟祥豹教授的幫助下進一步推測“81”的結構式，進行合成，終於確定“81”是三甲基五氨基戊酸。
從 2015 年年初到 2016 年暑假，這個過程整整持續了一年半。有了代謝物，我們才進行下一步的動物研究。
這個研究最開始就是我的博士研究生趙明明來做的，他從 2013 年本科畢業設計就提前來實驗室學習，2014 年就開始做這個研究，所以從剛開始的發現到後期動物實驗驗證基本由他主導完成。
在 2019 年 7 月份 Gastroenterology（胃腸病學雜誌）的修稿意見中編輯和審稿人的整體評價是研究邏輯很好，動物實驗也很紮實，最大的問題是 TMAVA 在臨床中的應用。
為了回答這個問題，我們有幸得到了復旦大學附屬中山醫院的趙琳博士的幫助，在非酒精性脂肪肝患者中進行了檢測和驗證。
像我前面提到的很多實驗，包括 TMAVA 的鑑定與合成、特定菌株的預測、 DavA 和 DavB 純化蛋白的驗證、分子結合力實驗、動物脂解實驗都得到很多教授（密歇根大學陳育慶教授，北京大學尹玉新和郭雪峰教授，澳大利亞新南威爾士大學楊宏遠教授）的指導和幫助，在這裡也一併感謝。
鄭樂民教授及其團隊
② 您覺得這項研究中最重要的突破有哪些？最有意思的發現又是什麼？研究過程中有沒有什麼有意思的插曲？
我們覺得這項研究中我們最重要的突破是再次推進了腸道活性代謝產物的研究，並且在動物和分子機制方面闡明瞭代謝物的作用。除了 TMAVA 本身的鑑定比較有意思外，我們覺得在尋找 TMAVA 前體 TML 時也比較有意思。
我們第一次發現這個 TMAVA 時，它的分子量恰巧與一個藥物的分子量相等，我們購買了藥物的標準品，發現色譜保留時間不同。
在確定 TMAVA 由腸道菌群代謝產生後，下一步的關鍵是找到 TMAVA 的前體，而根據產物推測前體沒有成熟的研究方法，我們就從 TMAVA 結構式入手，用 TMAVA 類似的物質檢索文獻。
無意間發現一篇文章報道：賴氨酸（lysine）可以通過菌群中 DavA 和 DavB 兩個酶產生五氨基戊酸（Liu et al., 2014），而 TMAVA 比五氨基戊酸多三個甲基，因此我們推測三甲基賴氨酸 TML 是不是可以在類似酶體系下產生 TMAVA。
非常巧合的是，“lysine 通過 DavA 和 DavB 兩個酶產生五氨基戊酸”的研究者是山東大學馬翠卿教授，通過馬教授贈予的 DavA 和 DavB 這兩個純化蛋白，我們發現在體外實驗中，TML 可以產生 TMAVA。
賴氨酸經 DavA 和 DavB 產生五氨基戊酸
③ TMAO（氧化三甲胺）是近幾年來腸道菌群研究中的“明星”代謝產物，從流行病學到分子機制到開發靶向性藥物，可謂是菌群代謝物研究的一個範例。您覺得 TMAVA 會不會成為下一個 TMAO？您和團隊接下來會開展哪些後續研究？
目前相關的心臟的臨床研究，正在和華中科技大學附屬同濟醫院一起進行，臨床結果希望今年能夠和大家分享，同時我們也做了大量的動物實驗，相關的心血管的數據也希望儘早和大家分享。
關於 TMAVA 雖然我們做了將近 5 年的研究，但是我們現在只能判斷它是腸道菌群代謝的產物，並且飲食中含有的 TML 可以產生 TMAVA。
TMAVA 有抑制肉鹼合成、導致脂肪肝作用。但是 TMAVA 是否還有其他的生物學功能或者類似 TMAO 有這麼多的病生理作用還需要同領域的研究人員進一步發現和證明。
我們發現 TMAVA 能通過和 BBOX 結合抑制肉鹼的內源性合成，由於時間的緊迫性，我們只在 BBOX 全身敲除的動物上進行了驗證。
如我們文章中提到的，雖然說 BBOX 在肝臟的表達是最主要的，但是其他器官也有不同程度的表達。因此我們現在已經制備了 BBOX flox 小鼠，接下來我們將在動物上驗證不同器官 BBOX 的表達對機體代謝的影響。
其次，我們雖然在動物實驗中發現給予肉鹼會逆轉 TMAVA 的疾病效應，但是真正在人群中是不是有效的，還需要進一步的臨床隨機試驗。特別是肉鹼在某類脂肪肝病人上的應用，可能具有很大的市場前景。
第三，我們現在主要認為 TMAVA 通過抑制肉鹼的合成發揮作用，但是 TMAVA 是否還有其他的信號通路，包括和其他蛋白的結合，特別是不是會和 TMAO 類似也存在細胞膜受體，這些都是我們下一步研究的方向，也希望同領域的研究人員進一步發現。
④ TMAVA 的前體三甲基賴氨酸（TML）主要常見於哪些飲食（或藥物）？這項研究發現對於預防脂肪肝有哪些啟示？在臨床轉化方面有哪些應用前景？
當時我們通過物質結構式推測 TML 是 TMAVA 的前體，同時在文獻中檢索 TML 的相關資料。
Hazen 團隊在 2018 年 JCI insight 上發表了一篇文獻對我們啟發很大（Li et al., 2018）。他們通過非靶向代謝組學發現 TML 是冠心病的獨立風險因素，並且獨立於 TMAO。在這篇文章中詳細分析了不同食物中 TML 的含量，他們發現一些海產品和肉類食物中含量較高。
因為 TML 需要經過腸道菌群產生 TMAVA，所以飲食中 TML 產生多少含量的 TMAVA 和腸道菌群密切相關。在飲食方面最重要的還是做到均衡飲食，而對 TMAVA 的產生更多的應該從腸道調節的角度思考，類似 TMAO 研究中通過 3,3-dimethyl-1-butanol（DMB）抑制腸道微生物中 TMA 裂解酶抑制 TMA 的產生，進一步降低 TMAO 的水平。
因此我們現在也在嘗試通過用益生菌或益生元改變腸道菌群，或是直接抑制參與 TMAVA 產生的微生物酶，都有可能降低非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的發生風險。
總之益生菌的作用很大，市場前景也很大，但是我們需要進一步來研究每種益生菌的特異性功能。
⑤ 在腸道菌群研究領域中，已有不少研究團隊將目光投向了代謝組學，包括您和團隊的這項研究，也是通過代謝組分析發現了 TMAVA。可否請您分享一下這方面的研究經驗？代謝組學是否會成為接下來腸道菌群研究的主旋律？
代謝組學以“無偏見”（unbiased）的方式比較廣譜的篩選代謝物，非常適用於複雜疾病的研究。因此在代謝研究領域，通過質譜進行代謝物的篩選和檢測是個極其重要的手段。我們這個研究的線索也是代謝組學提供的。
代謝組學是個有力的研究工具，但現在關於非靶向代謝組仍有亟待解決的問題。
首先，由於代謝在人體和動物體內是很容易發生改變的，因此做非靶向代謝組學時樣品的質量和匹配非常重要。
其次，在非靶向代謝組學本身方面，現在非靶向代謝組學可以一針檢測 5000+個m/z 的離子，但是數據庫能匹配到的明確代謝物一般在 1000 個以下。在這個過程中還存在錯配、m/z 的峰面積的不準確性，這些非常重要的問題。
而要解決這個問題，我們一方面在追求代謝物數據庫的不斷完善，或者多個數據庫的相互驗證包括在線數據庫 METLIN、HMDB 和不同實驗室或者質譜廠家 in-house 的數據庫。
但是由於不同儀器檢測時的參數不同，導致碎片離子或者離子強度不同，所以仍然導致一定的結果不可信。
另一方面就需要研究人員對照原始譜圖進行人工複核，這個操作涉及的數據量是巨大的，需要消耗很大的精力。如果複核發現存有差異，要再通過標準品進行驗證。
一般通過非靶向代謝組學找到差異代謝物後，再通過靶向代謝組學並擴大樣品量，以提高檢測準確性和靈敏度，發揮靶向組學在對目標代謝物的檢測上所具有的無與倫比的優勢。
靶向代謝組學是精準醫學的重要組成部分，會對人民群眾的健康以及慢性病的監控產生巨大影響，它已經成為繼基因檢測、蛋白檢測之後重要的體外檢測方法。
因此代謝組學不僅僅是腸道菌群研究重要手段，也是代謝領域研究重要的研究手段。但是剛剛提到的非靶向代謝組學存在的難題，還需要代謝和質譜領域的研究人員不斷完善解決。
另外，我們將通過和佰辰醫療的合作，讓腸道菌群的代謝測試儘快應用到疾病的檢測中，為菌群的疾病研究提供更為精準的標準，也為菌群相關的食品、保健品，甚至藥品提供更有效的測量標準。
採訪中涉及的文獻：
1.Koeth, R.A., Levison, B.S., Culley, M.K., Buffa, J.A.,Wang, Z., Gregory, J.C., Org, E., Wu, Y., Li, L., Smith, J.D., et al. (2014).gamma-Butyrobetaine is a proatherogenic intermediate in gut microbialmetabolism of L-carnitine to TMAO. Cell Metab 20, 799-812.
2.Li, X.S., Wang, Z., Cajka, T., Buffa, J.A., Nemet, I.,Hurd, A.G., Gu, X., Skye, S.M., Roberts, A.B., Wu, Y., et al. (2018).Untargeted metabolomics identifies trimethyllysine, a TMAO-producing nutrientprecursor, as a predictor of incident cardiovascular disease risk. JCI Insight3.
3.Liu, P., Zhang, H., Lv, M., Hu, M., Li, Z., Gao, C.,Xu, P., and Ma, C. (2014). Enzymatic production of 5-aminovalerate fromL-lysine using L-lysine monooxygenase and 5-aminovaleramide amidohydrolase. SciRep 4, 5657.
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