傳統甲烷氧化菌主導稻田土壤中大氣甲烷的氧化
Conventional methanotrophs are responsible for atmospheric methane oxidation in paddy soils
Impact Factor：11.878
https://doi.org/10.1038/ncomms11728
發表日期：2016-06-01
通訊作者：賈仲君([email protected])1
合作作者：鄭燕, Paul L.E. Bodelier,Ralf Conrad
主要單位：
1中國科學院南京土壤研究所土壤與可持續農業國家重點實驗室(State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing, Jiangsu Province 210008, China.)
寫在前面
分享標題：Nature子刊：南土所賈仲君組-揭示水稻土大氣甲烷氧化的微生物過程機制
關鍵字：甲烷氧化菌，CH4，乾溼交替，MTWAS，PHB，pmoA 基因，穩定同位素示蹤
點評：中國科學院南京土壤研究所賈仲君課題組解析了溼地土壤氧化大氣甲烷的機制，發現傳統甲烷氧化菌，而不是未知的難培養微生物在大氣甲烷氧化過程中發揮了主要作用。針對乾溼交替的水稻土，課題組提出了全轉錄組水平的微生物群落關聯技術理念MTWAS（metatranscriptome-wide association study），從數以千億計的遺傳信息中，解析了水稻土甲烷氧化過程的微生物代謝調控網絡。研究結果表明：高濃度甲烷刺激是水稻土氧化大氣低濃度甲烷的前提條件，MTWAS分析則發現傳統甲烷氧化菌利用高濃度甲烷過程中，合成了能量物質PHB，極有可能利用PHB氧化大氣甲烷，結合高通量功能基因檢測和穩定性同位素示蹤DNA技術，巧妙排除了難培養大氣甲烷氧化菌的貢獻。這一結果得到了審稿專家的高度評價，認為是溫室氣體排放領域的突破性成果、令人驚奇的發現，為全球甲烷和碳循環、氣候變化的計算模擬提供了新視角。
摘要
土壤是強溫室氣體甲烷的生物源，而在大氣中只有大約1.84 ppmv(part per million by volume)極低的濃度。
長期以來，人們一直認為這種“高親和力”甲烷氧化(HAMO)是由尚未被培養的消耗甲烷的細菌造成的。在這裡，我們展示了源於稻田土壤中傳統甲烷氧化菌的新興HAMO活性。在高濃度甲烷的低親和力氧化過程中，很快誘導出HAMO活性。此活性在2周內逐漸消失，但可以通過用高濃度的甲烷來衝喂土壤而重複獲得。HAMO活性的誘導是在甲烷氧化菌群快速生長後才發生的，轉錄組研究表明同時發生的高親和力和低親和力甲烷氧化是由已知的甲烷氧化菌催化的，而不是由提出的新型大氣甲烷氧化菌催化的。這些結果為定期排水的生態系統吸收大氣甲烷提供了證據，這些生態系統通常被認為是大氣甲烷的來源。
背景
甲烷（CH4）是僅次於CO2的第二重要的大氣溫室氣體，被認為解釋全球變暖的17％。需氧旱地土壤中的微生物會消耗大氣中的甲烷，而這些土壤主要暴露於接近或低於大氣中甲烷濃度1.84 ppmv的極低水平。土壤甲烷消耗動力學的理論計算表明，大氣中的甲烷不能為任何已知的產甲烷生物的存活提供足夠的能量支持。現有證據表明，擁有高親和力甲烷氧化酶(HAMO)的微生物屬於尚未被培養的甲烷氧化世譜系。這些譜系由山地土壤群alpha (USCa)和山地土壤群gamma (USCg)組成，這兩種土壤類群在好氧山地土壤(如森林和草原地區的土壤)中經常被發現，而在溼地土壤中則沒有。
溼地生態系統通常含有高濃度的甲烷，甲烷是有機物厭氧降解的最終產物。在這種情況下，眾所周知的低親和力甲烷氧化菌，包括I型(Gammaproteobacteria)和II型(Alphaproteobacteria)亞群，在好氧厭氧界面催化甲烷氧化。這些界面包括含氧表層土壤和溼地植物釋氧根周圍的區域。據估計，在厭氧區域產生的內源高濃度甲烷有80%在逸入大氣之前被甲烷氧化菌消耗掉。有趣的是，在乾旱季節，實地測量表明由於大氣中的甲烷以1.84 ppmv的量直接消耗，HAMO活性在一個沼澤區發生，而沼澤土壤在澇漬條件下是甲烷的淨來源。在許多其他類型的溼地中，也發現了甲烷源的這種變化，這些溼地水位波動較大，如泥炭地、潮汐淡水溼地和酸性溼地。然而，在這些週期性排乾的溼地中，大氣甲烷氧化的機制仍不清楚。
稻田可以作為定期排水溼地生態系統的模式系統，因為在亞洲，農業輪作的做法通常用於澇稻種植和旱地小麥種植。此外，稻田的季中排水會由於含水量的變化而導致土壤甲烷濃度的顯著波動。因此，我們使用水稻土作為模型系統，通過暴露在不同甲烷混合比例下，模擬週期性排水溼地土壤中甲烷波動的有效性。結果表明，
僅在土壤對10,000 ppmv的甲烷氧化後，HAMO的1.84 ppmv甲烷吸收活性才出現，並在2周後停止，但在重新將土壤暴露在10,000 ppmv甲烷中後可以重新獲得。儘管甲烷營養型種群的生長逐漸受到限制，但每天向土壤中添加10,000 ppmv甲烷(10天)，可以提高HAMO活性的耐受性。整個轉錄組的關聯研究（MTWAS）顯示，傳統甲烷氧化菌的關鍵酶具有很強的轉錄活性，表明多種胞內聚合物可以作為支持土壤HAMO活性的還原劑。我們的研究結果表明，在定期排水的溼地，傳統的甲烷氧化菌是造成大氣甲烷氧化的原因，而溼地通常被認為是大氣甲烷的來源之一。結果與討論
土壤中HAMO活性的發生與恢復
Emergence and resilience of soil HAMO activity
我們研究了好氧條件下，水稻土在5種不同混合比例甲烷條件下的甲烷氧化動力學，其包括環境條件下的2 ppmv和高濃度下的100、500、1000和10000 ppmv。在18天的培養期中，暴露於環境空氣和100 ppmv甲烷時，土壤中不會發生甲烷氧化（圖 1a）。然而，在經過10,000 ppmv甲烷馴化的微宇宙中，甲烷濃度在3天內迅速下降到2 ppmv，並進一步下降到0.6 ppmv(
圖. 1a)，表明土壤中HAMO活性的出現。有趣的是，在500和1000 ppmv甲烷馴化的微宇宙中，雖然頂空甲烷濃度分別下降到10和4 ppmv，但HAMO活性沒有被誘導出來。這些結果表明，可能需要臨界水平的甲烷轉化來誘導稻田土壤中的HAMO活性。圖1 水稻土高親和力甲烷氧化活性的發生與恢復
Emergence and resilience of high-affinity methane oxidation activity in paddy soil
(a)不同初始混合比例下甲烷的消耗動態。高親和力甲烷氧化(HAMO)活性僅發生在經10,000 ppmv處理的土壤中。誤差棒表示從三個微宇宙中測量的上下標準誤差。
(b) 在10,000 ppmv甲烷10次衝喂微生物條件下甲烷消耗的變化。頂部空間每天都要更換甲烷，以保持10000 ppmv的甲烷。紅色的線條：每次置換後的初始甲烷混合比例; 黑色的線條：培養1天后的甲烷混合比例；
(c,d) HAMO活性在1次(c)和10次(d)衝喂後逐漸喪失和恢復。淺灰色區域代表實驗期間大氣中甲烷混合比例的範圍，黑色線條表示經過數天培養後，土壤微生物中殘留的甲烷濃度。a-d圖中的黑鑽石圖標顯示了分別用於宏轉錄組分析的具有和不具有HAMO活性的土壤樣品。黑色的星號圖標表示用於對pmoA2基因進行定量PCR分析的土壤樣本，該pmoA2基因編碼了一種對甲烷具有高親和力新的顆粒狀甲烷單加氧酶，並可用於16S rRNA基因和轉錄本的高通量Illumina測序。
b-d中顯示的所有數據都是來自一式三份微宇宙的平均值。為了驗證出現HAMO活性的現象並評估其對甲烷轉化的依賴性，我們讓土壤再次暴露於10,000 ppmv甲烷(1次衝喂 1-TF)中，或者讓土壤與10,000 ppmv甲烷共孵育10天(10次衝喂 10-TF)，方法是每天更新一次頂空氣體(圖. 1b)。在10天的孵育期內，經過3-4天的孵育，土壤甲烷消耗量明顯增加。然而，隨後補充10,000 ppmv甲烷導致甲烷氧化率穩步下降，這表明，由於源於甲烷碳的過度供應，可能會導致營養匱乏(圖. 1b)。然後我們用環境空氣對這些1-TF和10-TF土壤組進行更新，以確定它們的HAMO活性。值得注意的是，10-TF土壤的HAMO活性並不比1-TF土壤高，儘管前者的甲烷累積氧化量是後者的三倍(圖. 1b)。經過三次頂空更新後，1-TF和10-TF土壤中甲烷的消耗動態確實非常相似，表明兩種土壤HAMO活性可能受到相似的功能導向和/或受大氣甲烷向土壤擴散的限制。經對水稻田中HAMO活性的測定，大氣甲烷消耗速率為每年4.46 kg CH 4ha–1。
但1次衝喂土壤的HAMO活性隨時間呈下降趨勢，2周後消失(
圖. 1c)。有趣的是，這種HAMO活性可以在升高的甲烷(10,000 ppmv)孵育下再次被誘導, 儘管隨後像以前一樣丟失HAMO的活性(圖. 1c)。這種活性的重新激活強烈表明，HAMO活性的恢復力和持久性取決於高濃度甲烷的週期性供應和隨後的消耗。在10-TF土壤中也觀察到了類似的出現和恢復的情景。HAMO活性下降速度與環境空氣下的1-TF土壤一樣快，但10天后，仍然能檢測到微弱的HAMO活性，且能持續>兩個月(圖. 1d)。值得注意的是，大多數可培養的甲烷氧化菌只有在消耗高濃度的甲烷後才能氧化大氣中的甲烷。當以與本研究中暴露的水稻土相似的方式暴露於1.84 ppmv的大氣甲烷中時，這種能力通常會在幾天內喪失。因此，這表明已知的甲烷氧化菌在週期性排水生態系統的大氣甲烷吸收中發揮著重要作用，在這種生態系統中，高甲烷量的衝喂通常伴隨著土壤地下水位的波動。與土壤HAMO活性相關的活躍的甲烷氧化菌
Active methanotrophs associated with soil HAMO activity
我們通過重建整個微生物群落的宏轉錄組設計了一種MTWAS策略，對HAMO和非HAMO土壤中的目標微生物進行比較分析。在10-TF土壤中，表達的基因和負責HAMO活性的甲烷氧化菌在6天內表現出很強的大氣甲烷吸收能力，而在沒有HAMO土壤中在18天的孵育期內沒有消耗100 ppmv甲烷 (圖. 1)。我們使用MG-RAST(Metagenomic Rapid Annotation using Subsystem Technology)服務器對2670萬個高質量信使RNA轉錄本進行了系統分類和功能分類。隨後，在水稻土壤甲烷氧化菌基因轉錄本檢測的基礎上，重建了甲烷氧化和碳同化的核心代謝途徑(圖. 2a)。HAMO土壤中存在著編碼兩種典型甲醛吸收途徑的酶基因轉錄本，I型甲烷氧化菌的一磷酸核酮糖(RuMP)途徑，II型甲烷氧化菌的絲氨酸途徑。對於甲醛同化的 embdon - meyerhof - parnas(即糖酵解)途徑和並行的Enthner–Doudoroff途徑在I型甲烷氧化菌中被檢測出來。雖然只發現了少數編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的gnd基因的轉錄本，但也發現了甲醛氧化和RuMP再生的異化RuMP循環。我們還觀察了與四氫葉酸(H4F)途徑相關的基因表達，該途徑將C1單位轉移到絲氨酸循環中，用於II型甲烷氧化菌的碳同化。我們檢測了涉及甲烷經甲醇、甲醛和甲酸氧化成二氧化碳的所有酶反應步驟的基因轉錄本。如相關與甲醇脫氫酶(由mxaF基因編碼)和甲酸脫氫酶(由
fdh基因簇編碼)的基因轉錄的高的表達表明，還原當量可由甲醇和甲酸鹽的氧化反應持續再生，並供給甲烷單加氧酶(MMO)。MMO可能是推動大氣甲烷氧化的關鍵酶。與預期一樣，甲醛在水稻土中通過四氫甲膽鹼依賴途徑被氧化成甲酸，這與之前對大多數甲烷氧化菌的批量培養研究一致。因此，這些發現表明已知的甲烷氧化菌在田間條件下可能發揮重要作用。圖2 水稻土中具有和不具有高親和力甲烷氧化活性的甲烷氧化菌的轉錄譜
Transcript profiles of methanotrophs in paddy soil with and without high-affinity methane oxidation activity
(a)在高親和甲烷氧化(HAMO)和非HAMO的水稻土中檢測到的甲烷氧化菌的甲烷氧化和碳同化途徑。基因轉錄丰度被歸一化為每200萬個註釋轉錄的讀長數。紅色和藍色的數字分別表示在HAMO和非HAMO土壤轉錄組中檢測到的轉錄豐富度。這些基因編碼的酶如下:acsA, 乙酰乙酰基CoA合成酶;atoB,乙酰輔酶a乙酰轉移酶;bdh, 3-羥丁酸脫氫酶;eda, 2-脫氫-3-脫氧磷酸葡萄糖酸酯醛縮酶;edd, 磷酸葡萄糖酸脫水酶;eno,烯醇酶;fad, 3-羥烷基-CoA脫氫酶;fae,甲醛活化酶;fbaA，果糖二磷酸酯醛縮酶fch，亞甲基四氫葉酸環水解酶；fdh，甲酸脫氫酶；fhcABCD，甲酰甲基呋喃脫氫酶；ftfL，甲酸四氫葉酸連接酶；
gap，3-磷酸甘油醛脫氫酶；gk，D-甘油2-激酶；glyA，絲氨酸羥甲基轉移酶；gnd,6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶；gpmI，不依賴於2,3-雙磷酸甘油酸的磷酸甘油酸突變酶；hbd，3-羥基丁酰基-CoA脫氫酶；hprA，羥基丙酮酸還原酶；hps，3-己糖-6-磷酸合酶；mch，亞甲基四氫甲蝶呤環水解酶；mcl，Malyl-CoA裂解酶；mmo，甲烷單加氧酶（可溶）；mtdA，亞甲基四氫葉酸脫氫酶；mtdB，亞甲基四氫甲蝶呤脫氫酶；mxaF，甲醇脫氫酶；pfk，6-磷酸果糖激酶;pgi，6-磷酸葡萄糖異構酶；pgl，6-磷酸葡萄糖酸內酯酶; pgk，磷酸甘油酸酯 激酶；phaZ，聚（3-羥基丁酸酯）解聚酶；phbB，乙酰乙酰輔酶A還原酶；phbC，聚-β-羥基丁酸酯聚合酶；phi，6-磷酸-3-己糖異構酶；pmo，甲烷單加氧酶（微粒）；pyk，丙酮酸激酶；sga，絲氨酸-乙醛酸轉氨酶；zwf，6-磷酸葡萄糖脫氫酶。虛線箭頭代表多個酶促反應。1,3-BPG，1,3-雙磷酸甘油酸酯; EMP途徑，Embden–Meyerhof–Parnas途徑;F-1，6-BP，果糖1，6-二磷酸；GAP，3-磷酸甘油醛；G6P，6-磷酸葡萄糖；KDPG，2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸酯；
MOB，甲烷氧化細菌；PEP，磷酸烯醇丙酮酸；2-PG，2-磷酸甘油酸酯;3-PG，3-磷酸甘油酸酯; 6PG，6-磷酸葡萄糖酸酯; 6PGL，
6-磷酸-葡萄糖酸-1,5-內酯;PHB，聚-β-羥基丁酸酯；H4F，四氫葉酸；H4MPT，四氫甲蝶呤。
(b)HAMO和非HAMO的宏轉錄組中pmoA譜系的轉錄豐富度。每個pmoA譜系的轉錄丰度被標準化為每200萬個註釋轉錄的讀長數。
(c) 檢測到的pmoA2轉錄本的系統發育(紅色)。該樹是使用MEGA 4.0基於125個衍生氨基酸序列構建的。pmoA2OTUs的代表來自pmoA基因擴增子焦磷酸測序(藍色)和pmoA2基因克隆文庫測序(綠色)，並且三種pmoA1序列的代表(紫色)也被顯示。自展支持率 > 50%(1,000次重複)的在節點上顯示。比例條表示5%的置信區間。
與甲烷營養細胞中常見的碳儲存聚合物聚-β-羥丁酸(PHB)代謝相關的基因轉錄本也得到了鑑定(圖. 2a)。當細胞受到飢餓、營養缺乏或缺乏還原劑等環境脅迫時，對於甲烷氧化菌來說，PHB代表了一種內源性的還原力來源(例如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH) 。PHB的積累常發生在碳過剩與氮限制條件下。10-TF土壤中的碳過量可以通過在10天衝喂後期觀察到的甲烷消耗的穩步下降得到明確的證明(圖. 1b)。固氮基因(固氮酶，由基因簇nifDKH編碼)和將細胞外的氨、亞硝酸鹽和硝酸鹽輸送到甲烷氧化菌細胞的基因較高的表達也證明了氮的限制。事實上，我們之前的研究結果表明，在本研究試驗的土壤中，當氮約束解除時，甲烷營養化種群和甲烷氧化速率都受到尿素參與的顯著刺激。總的來說，高甲烷消耗過程中的誘導應力可能會對甲烷氧化菌細胞的生物量積累產生深遠的影響，導致HAMO土壤中富碳化合物的積累(圖. 2a)。同時，需要注意的是，PHB循環相關酶的表達可能暗示活性碳的同化。環境應力和PHB積累之間的直接聯繫還有待實驗證實。
在所有甲烷營養基因和基因簇中，編碼顆粒狀甲烷單氧合酶(pMMO)的pmoCAB是關於HAMO和非HAMO土壤中標準化丰度最豐富的基因簇(圖. 2a)。對所有推測的pmoA轉錄本進行嚴格的分類顯示，在HAMO土壤中，最活躍的甲烷氧化菌譜系為
Methylosarcina(79.7%)、稻田集群2(3.2%)和I型甲烷氧化菌的稻田集群(3.2%)和II型甲烷氧化菌的Methylocystis(3.6%)(圖. 2b)。12287個pmoA轉錄本均與被提出的大氣甲烷氧化譜系USCa和USCg無關。通過對背景土、非HAMO土、1-TF和10-TF HAMO土的pmoA擴增子進行焦磷酸測序，證實了USCa和USCg譜系的缺失。甲烷氧化菌標誌物的深度測序也沒有發現在包括中國、印度尼西亞、意大利和越南在內的整個大陸水稻土壤中存在類似USCα和USCγ的pmoA基因的證據。因此，這些新提出的譜系似乎不太可能對水稻土中HAMO活性的出現有貢獻(圖. 1)。共441個pmoA轉錄本可被分配到II型甲烷氧化菌的Methylocystis。這一類群長期以來被認為是大氣中的甲烷氧化者。最近的一項研究表明，在菌株Methylocystissp. SC2中，HAMO活性是由一種新的pmoCAB2基因簇催化的，該基因簇編碼了傳統pMMO的同工酶(pMMO2)。在HAMO的 宏轉錄組中也檢測到了類似
pmoa2的轉錄本，但在非HAMO土壤中沒有檢測到(圖. 2b)。焦磷酸測序和克隆文庫測序進一步揭示了水稻土中系統分化的pmoA2基因(圖. 2c)，表明具有pMMO2的II型甲烷氧化菌的多樣性比以前估計的要大。使用各自的組特異性16SrRNA探針，通過催化報告沉積熒光原位雜交(CARD-FISH)進一步進行細胞可視化。這一分析揭示了典型的I型和II型甲烷氧化菌的獨特形態。這一結果提示了它們在水稻土中HAMO活性的發生和恢復中所起的作用。已知的甲烷氧化菌的生長和HAMO活性的誘導
Growth of known methanotrophs and HAMO activity induction
在HAMO活性的誘導和丟失過程中，通過實時定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR)對pMMO2-擁有型甲烷氧化菌的pmoA2基因進行定量，並通過Illumina MiSeq對所有其他甲烷氧化菌的16S rRNA基因及其一式三份的微宇宙的轉錄本進行測序。與失去HAMO活性的土壤相比，HAMO土壤中pmoA2基因的拷貝數普遍較高，I型和II型甲烷氧化菌的相對丰度也較高(
圖. 3)。我們進一步發現，在DNA和RNA水平上，在HAMO土壤中，I型甲烷氧化菌受到的刺激遠遠大於II型甲烷氧化菌。例如，與時間零點相比，I型甲烷營養體的生物量增加了15.58倍，而II型甲烷營養體在10-TF HAMO土壤中的生物量僅增加了3.95倍(圖. 3b,d)。在使用13CH4孵育的10-TF土壤中通過甲烷-C同化的甲烷氧化菌基於DNA的穩定同位素探針（DNA-SIP）進一步證實了該觀察結果。圖3 甲烷氧化菌的丰度與水稻土中高親和力甲烷氧化活性的出現和恢復有關
Abundances of methanotrophs associated with the emergence and resilience of high-affinity methane oxidation activity of paddy soil
(a)qPCR檢測每克溼重土壤(w.w.s.)中pmoA2基因拷貝數(擁有pmoA2基因的甲烷氧化菌)的變化。(b,c) 基於16S rRNA基因(b)和16S rRNA轉錄本(c)擴增子的Illumina MiSeq測序分析的II型甲烷氧化菌相對丰度的變化。(d,e) 基於16S rRNA基因(d)和16S rRNA轉錄本(e)擴增子的Illumina MiSeq測序的I型甲烷氧化菌相對丰度變化。誤差棒表示來自一式三份微宇宙測量值的正負誤差。柱子上上不同的字母表示有顯著差異(方差分析,P<0.05)。
DNA-SIP依賴於生長在13C基質上的活性微生物的細胞分裂。pmoA基因靶向qPCR分析顯示，大部分I型甲烷氧化菌是13C標記的，因為它們的基因組DNA是在分離的DNA梯度的重餾分中檢測到的(圖. 4a )。相比之下，在13C-DNA片段中只檢測到一小部分II型甲烷氧化菌和擁有pmoA2基因的甲烷氧化菌(圖. 4b,c)。此外，通過對來自每個DNA片段的~130萬個高質量的16S rRNA基因讀長的分析，我們還發現，在13C標記的DNA中，I型(56.7%)的甲烷氧化菌比例明顯高於II型(9.69%)的比例(圖. 4d,e)。儘管還不確定生物質碳的積累是源於甲烷基質還是微生物甲烷氧化產生的二氧化碳，這些結果為甲烷氧化菌群落的細胞分裂和繁殖提供了有力的證據。已有研究表明，I型甲烷氧化菌中有5-15%的生物量碳來源於CO2, 對於某些II型甲烷氧化菌，這一數字增加到50％，對於其他的，這一數字增加到62%。此外，如圖1b所示，在10000 ppmv時大於90%的13CH4在第3天和第4天被迅速消耗。由此產生的13CO2的量足以支持土壤HAMO活性出現期間的甲烷氧化菌生物量的積累。因此，
13C的I型甲烷氧化菌與II型甲烷氧化菌相比，其生長速度更快，這可能在很大程度上代表了之前在該土壤中測試的生命策略的差異，而不是HAMO土壤中碳的基質供應。有趣的是，當1-TF HAMO的土壤在環境空氣中培養~2周直至失去活性時，II型甲烷氧化菌的比例僅略有下降(13.1%)，而I型甲烷營養體下降了55%(圖. 3b,d)。這些結果進一步支持了II型甲烷氧化菌比I型甲烷氧化菌更能耐受環境脅迫(如基質飢餓)的假設，由此推測，II型甲烷營養體可能在HAMO水稻土中發揮重要作用。圖4 pmoA基因和甲烷氧化菌16S rRNA基因的定量分佈
Quantitative distributions of the pmoA gene and methanotrophic 16S rRNA gene
用13CH4和12CH4培養10天HAMO土壤的DNA片段的整個浮密度梯度上都有基因讀長。(a–c)pmoA基因在傳統I型甲烷氧化菌(a)、傳統II型甲烷氧化菌(b)和擁有pmoA2基因的II型甲烷氧化菌中的數量分佈(c)。標準化的數據表示為每個片段的基因拷貝數與每個處理的最大數量之比。(d,e) 基於總16S rRNA基因Illumina MiSeq測序的I(d)型和II (e)型甲烷氧化菌的百分比分佈。
已有研究提出，土壤中存在一個誘發HAMO活性的甲烷消耗閾值，本研究可能需要~6.67umol g-1的土壤。土壤微宇宙中表觀甲烷氧化速率與頂空甲烷濃度之間存在明顯的鐘形曲線。我們推測，甲烷氧化菌細胞的快速繁殖可能是在土壤暴露於高濃度甲烷時立即發生的，從而導致土壤甲烷氧化的表觀速率越來越高。但是，當每克土壤消耗6.67umol甲烷後，表觀氧化速率達到最高值時，最適生長可能會使養分資源迅速減少。在日益增加的壓力條件下，甲烷氧化速率開始下降，而細胞生長可能停止，導致富碳化合物在甲烷氧化菌細胞中富集，從而誘導HAMO活性。因此，如果累積消耗量達到每g土壤中6.67 umol甲烷的閾值，那麼在濃度為500或1000 ppmv時持續供應甲烷可能會誘發HAMO活性，這似乎是合理的。然而，不同類型土壤的閾值可能有很大差異，其潛在機制仍不清楚。
土壤HAMO活性的機理及生態意義
Mechanism and ecological significance of soil HAMO activity
本研究結果清楚地表明，HAMO活性依賴於高濃度甲烷的頻繁供應，這為在自然環境下假設的衝喂機制提供了第一個實驗證據。這一理論概念解釋了週期性排水溼地中大氣甲烷氧化的現象。我們認為，由於地下水位下降，淹水期厭氧聚合生態位內產生的高濃度甲烷會緩慢向上擴散，促進表層土壤好氧/厭氧界面的甲烷氧化菌快速生長。這種低親和力的消耗進一步促發了乾旱季節(當排乾的需氧土壤暴露於周圍空氣中時)甲烷氧化菌吸收大氣甲烷以實現高親和力的HAMO活性。本研究評估稻田土壤的低、高親和性，為定期排水溼地大氣甲烷氧化提供了機制依據。根據本研究觀察到的HAMO活性，考慮到全世界有4.1億公頃的稻田定期進行排水管理，大氣甲烷的匯強度估計每年高達40萬噸。
水稻土中的HAMO活性很可能是在低養分、脅迫誘導條件下獲得的。在10天的培育期中，每天衝喂10,000 ppmv甲烷一次，在第4天激發了顯著的甲烷氧化活性。然而，從第5天開始，這種低親和氧化反應就大大減慢了，這表明甲烷氧化菌的功能逐漸受到損失。同時，由於土壤中氮的限制和氧的消耗，生態位惡化的過程也可能嚴重加劇。因此，10-TF土壤中甲烷氧化菌的快速生長所產生的環境脅迫可能比1-TF土壤(
圖. 1a,b)強得多，導致了還原劑(如 NADH)和PHB的積累量增加。這一結果可以解釋在10-TF土壤和1-TF土壤中，>2個月的HAMO活性更強(圖. 1c,d)。這些內源儲備物質長期以來被認為是MMO酶支持培養的甲烷氧化菌HAMO活性的還原力。事實上，HAMO活性的喪失常常被解釋為還原力的耗盡。MTWAS結果揭示了II型甲烷氧化菌中與PHB代謝相關基因的轉錄活性，表明它們對HAMO活性的誘導具有重要作用。越來越多的證據表明，II型甲烷營養生物比其I型甲烷氧化菌更貧營養，這可能賦予了前者儲存化合物合成的優勢。有趣的是，幾乎所有II型甲烷氧化菌的pmoA轉錄本在系統發育上都與Methylocystis密切相關，而Methylocystis是迄今為止最貧營養的甲烷氧化菌。儘管在如此低的甲烷濃度下沒有觀察到生長，但是某些Methylocystis菌株甚至可以在大氣中氧化甲烷長達3個月。最近的宏分析表明，在週期性排水的生態系統和高地土壤中普遍存在Methylocystis，在其田間土壤中經常檢測到大氣甲烷氧化。在本研究中，HAMO活性的維持可能部分解釋為
pmoA2基因的表達，該基因僅存在於HAMO土壤中 (圖. 2c)。重要的是，該基因對甲烷飢餓條件下的Methylocystis的生存至關重要。應該指出的是，一些Methylocystis菌株可以使用醋酸鹽作為碳源，醋酸鹽氧化產生的還原力可以維持HAMO活性。I型甲烷氧化菌也可能在大氣甲烷氧化中起作用。在HAMO的宏轉錄組中觀察到的pmoA轉錄本數目非常高，高達9638個，表明與Methylosarcina具有高度的序列相似性。幾種I型的甲烷氧化菌已經顯示出在大氣水平下氧化甲烷的短暫能力。然而，I型甲烷氧化菌被廣泛認為是競爭者，其pmoA轉錄本很可能是在HAMO土壤中快速消耗高濃度甲烷的過程中合成的。Methylosarcina物種是否能消耗大氣中的甲烷也是未知的。同時，在已知的I型甲烷氧化菌中，PHB合成的基因組證據仍然缺失。然而，不能排除的可能性是，其他儲存化合物可能用於支持I型甲烷氧化菌中的HAMO活性。例如，在HAMO轉錄組中檢測到糖原代謝的基因轉錄本。考慮到所有被測試的I型甲烷氧化菌都儲存糖原，它們也應該能夠在飢餓條件下通過使用這種儲存化合物向pMMO提供還原劑。此外，如純培養所示，中間代謝物，如甲醇或甲酸鹽，也可作為還原劑來維持HAMO活性。因此，
在高分類學分辨率下使用選擇性抑制劑來區分甲烷氧化菌，可能對量化不同已知甲烷氧化菌對土壤中大氣甲烷氧化的相對貢獻有很大的前景。總之，我們的結果表明，只有在水稻土中高濃度的甲烷被消耗後，才能誘導大氣中的甲烷才被氧化。然而，除非土壤定期被高濃度的甲烷沖刷，否則誘導活性就會喪失。在耗盡衝喂的甲烷時，甲烷氧化菌可能依賴於內源性存儲化合物（例如PHB）作為共同底物來維持細胞活力，同時消耗大氣中的甲烷。水稻土中同時發生的高親和力和低親和力的甲烷氧化是由已知甲烷氧化微生物菌群催化的，而不是USCa和USCg中假定的大氣甲烷氧化菌群。水稻土中HAMO活性的出現和恢復為更好地理解週期性排水生態系統中的甲烷轉化提供了機制基礎，並且有必要重新評估陸地生態系統中的大氣甲烷氧化，以減少全球甲烷預算的不確定性。
方法
土壤樣品的原位描述
Site description of the soil samples
土壤樣本取自江蘇省揚州市中國典型亞熱帶農業區的一塊主要用於水稻和小麥輪作的水稻田。水稻收穫後，用土鑽收集3個重複的土壤芯(深度為0-15釐米)，過2毫米的篩網進行混勻，然後在4攝氏度下保存，直到進一步使用。土壤特徵如下：最大持水量,55%;總有機碳,15g kg-1;總氮,1.59 g kg-1;總P, 1.23 g kg-1;pH 7.4。
甲烷衝喂的微宇宙體系構建
Microcosm construction with the flush-feeding of methane
微宇宙體系建造之前，於環境空氣條件下，土壤在60%持水量和28 °C的黑暗環境中培養4天。然後，將0.5 g溼重的土壤放入無菌的2毫升含有1ml RNAlater (Ambion)離心管中，作為初始樣品(時間記為0時刻)，保存在-20℃下，直到核酸提取。如前所述，將5g預培養的水稻土加入到120 ml的血清小瓶中，蓋上丁基橡膠塞子。分別以高濃度甲烷進行1-TF和10-TF處理。1-TF微宇宙的初始甲烷濃度為10,000、1,000、500、100和2 ppmv(環境空氣)。在10-TF微宇宙中，10,000 ppmv的 CH4每天更新一次，持續10天。用氣相色譜-火焰離子化檢測器(GC-FID)(Shimadzu GC12-A, Japan)測定了每瓶頂空的甲烷濃度。HAMO活性指的是在微宇宙中頂空甲烷在2 ppmv以下的消耗。頂空氣體用環境空氣沖洗以監測HAMO活性的持續性。當土壤不能氧化大氣中的甲烷時，將其再次暴露於10,000 ppmv的CH
4中，測定HAMO活性三次。在用環境空氣沖洗頂空氣體後，採用與1-TF土相同的方法對10-TF土的HAMO活性進行了監測。當土壤獲得或失去HAMO活性時，進行破壞性土壤取樣。實驗期間還對裝有10,000 ppmv CH4的空瓶進行了監測，以確保沒有氣體洩漏。所有處理至少進行了三次重複。水稻土的HAMO活性是根據前3或3.5 h可被氧化的大氣CH4含量來評估的。120ml瓶中CH4濃度下降速率為0.18584 ppmv h-1(1-TF和10-TF處理的平均值),土壤覆蓋面積為~1.256*10-3m2，深度為
~0.5釐米。假設在稻田中，可以誘導2 cm表層土壤的HAMO活性，在25℃，1 atm的壓力下甲烷密度為0.7163 gl -1。據估計，HAMO土壤的大氣甲烷氧化速率可能高達每天每平方米305.22 mg，相當於每年4.46 kg ha-1。
核酸提取
Nucleic acid isolation
如前所述(稍加修改)，從土壤樣品中提取總核酸含量。簡而言之，土壤樣品儲存在-20℃的RNAlater中，在冰上解凍，重懸，在20000 g的條件下離心聚集1分鐘。然後將離心產物與0.5 g玻璃珠混合，用酸性裂解緩衝液進行兩輪細胞裂解。採用水飽和酚(pH 4.5)、酚氯仿異戊醇(25:24:1, (vol/vol/vol), pH 4.5) 、氯仿異戊醇(24:1, (vol/vol), pH
5.5) 依次提取上清。使用兩倍體積的PEG NaCl沉澱核酸，用400 ml 70％乙醇洗滌，重懸於50 ml無核酸酶的H2O中，其中10 ul稀釋10倍，用於基於DNA的擴增。對於RNA分離，其餘的提取物用重組DNase I（Takara）處理以消化DNA，然後使用RNeasy Mini Kit(Qiagen, Germany)純化。採用以純化RNA為模板的通用16S rRNA基因引物(515F, 50-GTGCCAGC
MGCCGCGG-30; 907R, 50-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-30)進行PCR擴增以排除DNA汙染。使用PrimeScript 1鏈cDNA合成試劑盒(TaKaRa)和隨機六聚體將總RNA轉化為互補DNA (cDNA)，並保存於-20°C用於擴增子測序。
水稻土的宏轉錄組分析
Metatranscriptomic analysis of the paddy soil
從HAMO(10-TF土壤，6天內表現出強烈的的大氣甲烷吸收)和非HAMO(經100 ppmv甲烷修飾的土壤，在18天的潛伏期內沒有甲烷氧化)土壤(如圖1所示)中分別獲得了宏轉錄組。按照上述方法從一式三份的微宇宙中提取每個土壤樣品的總RNA，並將其彙集在一起。然後，使用Ribo-Zero Magnetic Kit試劑盒(Bacteria; Epicentre)將rRNA去除。使用Superscript Double-Stranded cDNA Synthesis kit(Invitrogen)和隨機六聚體引物獲得cDNA，然後使用Covaris M220將其裂解為~200 bp。文庫使用TruSeq DNA Sample Prep Kit構建，測序在Illumina HiSeq2000平臺進行。
原始FASTQ數據文件被提交到MG-RAST 3.0進行分類和功能註釋。信使RNA轉錄本的分類學隸屬關係是使用M5NR蛋白數據庫中的“Best Hit Classification”方法確定的，參數如下:平均e值小於或等於1e-5，平均比對長度≥30 aa和平均%identity ≥60。將隸屬於甲烷氧化菌的轉錄本選擇到workbench中，然後使用Subsystem 數據庫對這些轉錄本(平均e值≤1e-10，平均比對長度≥30 aa和平均%identity ≥60)進行功能註釋。在重建甲烷和氮的代謝途徑之前，將HAMO和非HAMO宏轉錄組中每個功能類別的轉錄本丰度標準化為Subsystem數據庫註釋的每百萬總轉錄本中的讀長數。
我們選擇了HAMO和非HAMO 宏轉錄組中所有假定的pmoA基因轉錄本來推斷活性甲烷氧化菌的分類特徵。這個過程是這樣進行的。(1)如前所述，我們已經完成了一個包含6,628個可培養甲烷氧化菌株和尚未培養甲烷氧化生態型(如USCa和USCg)的pmoA和pmoA相關序列數據庫的準備工作。(2)完成了土壤中pmoA基因轉錄本的篩選。首先利用GenBank nr數據庫作為註釋源，對MG-RAST中兩個宏基因組進行基因功能註釋(e值≤1e-5，平均比對長度≥30 aa和平均%identity ≥60)；然後，選擇所有假定的pmoA序列(功能註釋中含有“甲烷單加氧酶”)並以fasta格式下載。(3)根據pmoA數據庫(步驟1)對假定的
pmoA序列進行BLAST搜索，然後使用前面所述的MEGAN中最低共同祖先法將其分類為已知的pmoA譜系。將HAMO和non-HAMO宏轉錄組中每個pmoA譜系的轉錄本丰度標準化為使用GenBank nr數據庫註釋的每200萬個轉錄本中的讀長數。水稻土中活性甲烷氧化菌的穩定同位素示蹤
Stable isotope probing of active methanotrophs in paddy soil
為了監測活躍的甲烷氧化菌在HAMO活性出現和恢復期間的活動情況，分別用10,000 ppmv ,13CH4和12CH4的DNA-SIP孵育作為標記處理和對照處理。在10-TF微宇宙中進行破壞性採樣。使用FastDNA spin kit (MP Biomedicals, Cleveland, OH, USA)根據製造商的說明對土壤提取基因組DNA。DNA-SIP分餾按前面描述的方式進行。生成多達14個梯度部分，並使用AR200數字手持折射計(Reichert, Inc., Buffalo, NY, USA)測定每個部分的折射率。分離的DNA經PEG-6000沉澱法回收，於30 ml TE緩衝液中重懸，用於MiSeq測序和real-time qPCR。
pmoA基因的焦磷酸測序
Pyrosequencing of pmoA gene
利用pmoA基因的多重擴增子焦磷酸測序技術對水稻土甲烷氧化群落進行了綜合評估。選取time zero、non-HAMO、1-TF HAMO和10-TF HAMO土壤的DNA樣本，利用barcode引物A189f/A682r進行PCR擴增。將來自一式三份微宇宙匯聚的擴增子按等摩爾比混合，並在Roche 454 GS FLX Titanium sequencer(Roche)上進行測序。通過Mothur軟件(版本1.33.3)使用‘trim.seqs’和‘split groups’命令處理原始序列文件，用於質控和分樣。然後，使用在線版本的FunGene Pipeline對這些讀長進行處理，使用USEARCH 6.0檢查chimera，使用FramBot對frameshifts進行校正。每個樣本的高質量pmoA序列被歸類為上述已知的pmoA群或譜系。選取某一特定類群或譜系的pmoA序列，從MEGAN處下載，基於通過距離cutoff值為0.07的FunGene流程將其推斷的氨基酸序列聚類成種級操作分類單元(OTU)。提取每個譜系(各譜系優勢OTU的代表)的一個代表和pmoA2基因主要OTU的幾個代表，並將其用於系統發育分析。通過具有1,000個重複引導的MEGA 4.0利用neighbour-joining方法建立了pmoA的系統發育樹。
pmoA2基因的克隆文庫構建
Clone library construction of the pmoA2 gene
在10-TF土壤中也構建了pmoA2基因的克隆文庫。如前所述，pmoA206f/pmoA703b引物對用於擴增pmoA2基因。將3個重複擴增子彙集到一起，連接到pGEM-T載體(Promega, Fitchburg,
WI, USA) 上，並轉化進合格的DH5α感受態細胞中。隨機選取陽性克隆進行Sanger測序，獲得23條pmoA2序列。通過FunGene流程進行OTU聚類和代表性序列的挑選。
pmoA基因的定量
Quantification of the pmoA gene
如前所述，利用引物對A189F/Mb601R和II223F/II646R，通過qPCR對片段DNA中I型和II型甲烷氧化菌的常規pmoA基因丰度進行定量。利用引物對pmoA206f/pmoA703b測定了不同甲烷處理土壤和片段DNA中pmoA2基因的拷貝數。反應在20 ul混合物中進行，其含10.0ul SYBR Premix Ex Taq (Takara)和每個引物0.5mM及1ulDNA模板。所有qPCR檢測(一式三份)均在CFX96 Optical Real-Time Detection System (Bio-Rad, Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)上進行。分別用包含有相應
pmoA基因片段的質粒進行系列10倍稀釋得到相應的標準品。三對引物的擴增效率均在81.5 ~ 94.1%之間，R2值為0.993 ~ 0.998。16S rRNA基因及其轉錄本的MiSeq測序
MiSeq sequencing of the 16S rRNA genes and their transcripts
通過Illumina MiSeq對來自三個重複微宇宙的16S rRNA基因和轉錄本進行測序，評估了不同採樣點的微生物群落結構。還對DNA-SIP各組分的微生物群落組成進行了評估。515F / 907R引物對被用於擴增16S rRNA基因的V4-V5區，並將12 bp的特異性樣品接頭序列連接到515F的5’端。使用TaKaRa
Taq Hot Start Version (TaKaRa, Japan) 以50ul的總體積包含1.5U TaKaRa Taq HS,4 ul dNTP混合物(10 mM),5ul 10* PCR緩衝液,0.5ul牛血清白蛋白(20mg ml -1Takara),每種引物1ul(10 mM)和1ul模板DNA進行PCR。PCR條件為:94℃2 min;30個循環，包括94℃30秒、60℃30秒和72℃45秒;隨著最後一步72 °C5分鐘的延伸後，所有擴增子均在經Goldview染色的1.2％(W/V)的瓊脂糖凝膠上進行驗證，並使用MiniBEST DNA片段純化試劑盒3.0版(TaKaRa)進行純化，用NanoDropND-1000分光光度計定量，並按等摩爾比混合。
使用TruSeq Nano DNA LT Sample Prep Kit Set A (24個樣品)構建文庫，並按照製造商的方案使用MiSeq Reagent Kit
v3（600個循環）進行測序。
雜交技術
CARD-FISH
我們使用雜交技術來識別I型和II型甲烷氧化菌，以及前面描述的總細菌。如先前描述的進行一些修改，從1.0g水稻土中一式三份提取細胞。簡而言之，首先將土壤懸浮於10 ml 0.2％焦磷酸鈉中，並通過渦旋振盪15分鐘使其勻漿，然後將土壤勻漿鋪在相同體積的飽和蔗糖溶液(1.33g ml-1)上。5500 g離心2分鐘後，將含有細菌細胞的上層蔗糖級分倒入新的15ml聚異丁烯離心管中，用1/3體積的0.8％NaCl稀釋，並在4°C下於12,000g離心10分鐘。然後用4ml 0.8% NaCl重懸細胞聚集物，轉移到含有4ml Nycodenz溶液(1.310g ml-1)的10ml滅菌管中。在4°C下以9,500g離心25分鐘後，回收Nycodenz和水層之間的細胞層，洗滌，然後在4°C下以12,000g離心10分鐘使其沉澱。用0.2ml PBS重懸細胞沉澱，用於雜交分析和4,6-二氨基-2-苯基吲哚染色。簡而言之，在25℃下用甲醛（2％的最終濃度）固定45分鐘後，將細胞懸浮液過濾到0.22mm的聚碳酸酯膜（Millipore）上。然後，將濾膜用1倍的PBS洗滌，風乾，在37℃下用溶菌酶（10mg / ml 1）處理30分鐘，並再次用水洗滌。
然後將濾膜與辣根過氧化物酶標記的探針在雜交溶液中於46°C雜交3小時。用探針EUB I-III、Mγ669和Mα450分別對總細菌和I型和II型甲烷氧化菌進行16S靶向rRNA雜交。探針NON338作為陰性對照。然後將濾膜用洗滌緩衝液洗滌(在48°C下30分鐘)，轉移到含有0.0015％H
2O2和1mg ml-1Oregon Green標記的乙酰胺的擴增緩衝液中，在46 C下洗滌30 min，並用1*PBS洗滌 並在25℃，黑暗中用4,6-二mid基-2-苯基吲哚(50ng ml-1)染色10分鐘。在濾膜包埋在Citifluor / Vectashield混合物中後，用落射熒光顯微鏡下觀察濾膜並拍照(Nikon Eclipse 80i)。數據提交
Data availability
所有支持本研究結果的序列數據已存入以下公共數據庫。16SrRNA和pmoA基因的原始擴增子序列數據集已根據登錄號ERP008876存入European Nucleotide Archive(ENA)。轉錄組數據已存儲在MG-RAST中，其登錄號為4553284.3和4553285.3。從克隆文庫測序獲得的所有pmoA2基因序列均已存入GenBank，登錄號為KP218949至KP218971。圖(圖2-4)的源數據隨文章提供在補充信息文件中。作者聲明所有支持本研究結果的相關數據均可在文章中獲得，並可根據要求提供補充信息。
編譯：馬騰飛 南京農業大學 莫永亮 中科院南土所
Yuanfeng Cai, Yan Zheng, Paul L.E. Bodelier, Ralf Conrad,Zhongjun Jia. Conventional methanotrophs are responsible for atmospheric methane oxidation in paddy soils.Nature Communications volume 7, Article number: 11728 (2016) doi: https://doi.org/10.1038/ncomms11728
賈仲君，中科院南京土壤研究所研究員、博士生導師。1997年畢業於山西大學；2002年於南京土壤研究所獲博士學位。2002-2003研究草地土壤大氣甲烷氧化微生物(美國農業部與科羅拉多礦業大學);2003-2006年從事稻田甲烷和氨氧化微生物生理生態學研究(日本名古屋大學);2006-2008年從事土壤氨氧化微生物生理生態學研究(馬普陸地微生物研究)。2008年入選中國科學院引進國外傑出人才項目百人計劃。從事土壤環境微生物研究。採用穩定同位素原位標記土壤微生物核酸DNA的先進手段，在國際上首次提出證據表明氨氧化細菌，而非氨氧化古菌是農田土壤氨氧化過程的主要驅動者 ；在國際上首次發現非水生環境（土壤）存在特異的T4噬菌體；稻田生態系統甲烷氧化和氨氧化既可能相互促進，也可能相互抑制。採用熒光實時定量PCR標靶功能基因技術，顯著提高了13C-DNA檢測靈敏度，發現氨氧化細菌AOB主導德國典型農田土壤氨氧化過程；進一步開發了新一代454高通量測序為基礎的DNA-SIP技術，初步定量了氨氧化細菌AOB和氨氧化古菌AOA對農田土壤硝化過程的相對貢獻，表明AOB主導我國華北平原典型潮土氨氧化;結合硝化抑制劑技術，清楚揭示了複雜農田土壤中硝化微生物群落無機化能自養生長的生理代謝特徵。相關研究成果發表在國際知名刊物如Nature Communications ，Environmental Microbiology， The ISME Journal等雜誌。曾獲國際全球變化分析研究培訓系統總部（START）傑出青年科學家獎，中國科學院院長優秀獎，江蘇省科技進步一等獎，江蘇省“333高層次人才培養工程”培養對象榮譽稱號。
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