重大进展，拓宽Cas9靶向范围及降低脱靶效率

化脓链球菌Cas9（SpCas9）及其工程变体的靶向范围在很大程度上限于含有G碱基的原间隔物相邻基序（PAM）序列。

2020年2月10日，博德研究所David Liu背靠背在Nature Biotechnology 在线发表题为“Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs”的研究论文，该研究报告了三种新的SpCas9变体的进化，它们使用噬菌体辅助的非连续进化共同识别了NRNH PAM（其中R是A或G，H是A，C或T），三种新的噬菌体辅助的DNA连续进化策略结合和DNA切割的第二选择。这些进化的变体和SpCas9-NG的靶向能力在HEK293T细胞中进行了表征。进化的变体介导了人类细胞中插入缺失的形成和碱基编辑，并且使镰状细胞贫血突变的A•T到G•C碱基编辑能够使以前无法编辑的CACC PAM进行。这些新进化的SpCas9变体与先前报道的变体一起，原则上可以靶向大多数NR PAM序列，并大大减少了基于Cas9的方法无法获得的基因组位点的比例。

胞嘧啶碱基编辑器（CBE）使基因组DNA中的目标C•G到T•A转换成为可能。最近的研究报道，原始的CBE BE3在小鼠胚胎和水稻中诱导低频率的全基因组不依赖Cas9的脱靶C•G到T•A突变。2020年2月10日，博德研究所David Liu背靠背在Nature Biotechnology 在线发表题为“Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors

CBE是基因组编辑蛋白，由与催化受损的Cas9蛋白融合的胞苷脱氨酶和一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白（UGI）组成。在由Cas9向导RNA置换的单链DNA环中，碱基编辑活动窗口内的胞嘧啶脱氨 ，这部分内容已受到UGI的基本保护。相对DNA链的选择性切口使细胞DNA修复偏向于取代未编辑的链，从而导致目标C•G碱基对（bp）转换为T•A碱基对。CBE已在许多细胞类型和生物体（包括人类遗传疾病的动物模型）中实现了高水平的单核苷酸多态性（SNP）转换和低水平的indel缺失。

与其他Cas9指导的基因组编辑工具类似，碱基编辑器可以绑定到与靶原间隔子具有高度序列同源性的脱靶基因组位点。这些依赖于Cas9的脱靶结合事件的一个子集可以导致碱基编辑，可以通过使用具有更高DNA特异性的Cas9变体或通过将碱基编辑器作为瞬时蛋白质-RNA复合物来实现。

最近报道说，原始CBE BE3在小鼠胚胎和水稻中过表达时，会诱导全基因组范围内的随机突变，平均频率分别为5×10^-8 / bp和5.3×10^-7 / bp。这些偏离目标的编辑可能源自BE3脱氨酶域的内在DNA亲和力，而与Cas9的指导RNA编程的DNA结合无关。Ye和他的同事随后证明，CBEs还可以在人诱导的多能干细胞中诱导不依赖于Cas9的脱靶突变。与Cas9依赖的脱靶编辑不同，Cas9依赖的脱氨作用发生在细胞之间的不同基因座上，从而难以通过靶向的高通量测序来表征。广泛的全基因组测序（WGS）实验低通量，昂贵且费时，限制了其用于评估和工程化Cas9独立脱氨活性降低的CBE变异体。在这里，研究人员描述了有效评估碱基编辑器引起Cas9独立脱氨的倾向的方法的发展，以及这些方法在鉴定和工程化最小化Cas9独立DNA编辑的CBE变异体中的应用。

该研究开发了多种快速，经济高效的方法来筛选不同CBE在大肠杆菌和人细胞中诱导Cas9独立脱氨的倾向。该研究使用这些测定法来鉴定具有减少的与Cas9无关的脱氨基作用的CBE，并通过全基因组测序验证YE1（缩小窗口的CBE变体）显示背景水平的与Cas9无关的脱靶编辑。研究人员设计了YE1变异体，该变异体保留了高活性CBE的底物靶向范围，同时保持了最少的与Cas9无关的脱靶编辑。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41587-020-0414-6

https://www.nature.com/articles/s41587-020-0412-8

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關鍵字: 大肠杆菌 脱靶 靶向