一種更精確高效檢測R-loop的方法

R-loop是生物體在轉錄過程中形成的特殊的三鏈核酸結構，轉錄過程中新合成的RNA鏈與模板DNA鏈互補配對，形成的DNA:RNA雜合雙鏈與非模板DNA鏈一起被稱為R-loop

R-loop的異常導致多種人類疾病的發生，包括很多神經以及神經退行性疾病【4,5】和癌症的形成【6】。因此，對R-loop的形成以及功能方面的研究有助於於我們對疾病的認識。檢測R-loop在基因組中的定位是研究R-loop功能首先要解決的問題。

目前，主要有兩種檢測R-loop基因組定位的方法。第一種方法依賴於S9.6抗體，S9.6能夠識別DNA:RNA雜合雙鏈，這類方法包括DNA:RNA immunoprecipitation (DRIP)，以及基於DRIP的改進的方法：bis-DRIP，S1-DRIP和RDIP【7-10】。這類方法應用比較廣泛，但實驗操作比較劇烈，會損傷一些相對弱的R-loop，並且研究發現S9.6能夠結合雙鏈RNA。另外一種方法是依賴於RNaseH，RNaseH能夠識別DNA:RNA雜合雙鏈。這類方法包括DNA:RNA in vitro enrichment (DRIVE)【8】和R-loop chromatin immunoprecipitation (R-ChIP)【11】。R-ChIP需要首先獲得穩定表達RNaseH的細胞系，這在很多疾病細胞中並不容易獲得，因此解決這些問題並開發精確高效的R-loop檢測方法非常重要。

近日，美國賓夕法尼亞大學Kavitha Sarma和Roberto Bonasio團隊（共同一作為Qingqing Yang和Emily Shields）在Cell Reports上發表文章Mapping Native R-Loops Genome-wide Using a Targeted Nuclease Approach，開發了一種高效檢測R-loop的方法——MapR。

Mapping R-loops (MapR)是一種依賴於RNaseH，並結合CUT&RUN【12,13】技術來檢測基因組中R-loop的方法。在MapR中，失去了催化功能的RNaseH能夠結合R-loop，進而利用融合蛋白中的微球菌核酸酶MNase對核酸鏈進行切割，釋放包含有R-loop結構的核酸序列。MapR過程如下圖所示，首先將細胞結合到concanavalin A beads上(step1)；然後加入失去催化活性的RNaseH 與MNase的結合蛋白(RH∆-MNase)，鈣離子缺失時，MNase不會發生催化反應(step2)；加入鈣離子，激活MNase活性， MNase會在RH∆結合位點兩端對核酸進行切割，30分鐘後加入EGTA和EDTA終止反應(step3)；核酸片段從細胞核內釋放並回收純化(step4，step5)，進行高通量測序。

相對於其它檢測R-loop的方法，MapR具有以下幾個特點：1）MapR的整個實驗過程是在細胞內，並且利用MNase對核酸序列進行切割，能夠檢測到一些相對弱的或是瞬時形成的R-loop；2）MapR不依賴S9.6抗體，不需要構建穩定表達RNaseH的細胞系，整個實驗過程只需要一天時間，並且適用於不同的細胞類型；3）MapR技術也可以在少量細胞有效的檢測到R-loop，因此可以用來檢測人類某些疾病細胞中R-loop的變化。

目前MapR的方法是利用雙鏈DNA建庫測序，不能明確的區分DNA:RNA雜合雙鏈中的DNA是正鏈或負鏈，在以後的研究中將會通過單鏈DNA或者RNA建庫解決鏈特異性問題。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.09.052

參考文獻

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