許多疾病由特定的致病蛋白積累引起，而特異性降解這些致病蛋白可以從根本上干預或治療疾病，具有重要的科學及臨床價值，給生物醫藥領域帶來革命性進展。以亨廷頓病為例，引起該病的變異亨廷頓蛋白生化活性未知，無法依靠傳統阻斷劑阻斷變異蛋白活性，而直接降低變異亨廷頓蛋白水平極具治療前景。

如何利用小分子藥物特異性地降低致病蛋白而不影響對應的野生型蛋白水平是領域長期以來的一大難題。在基因編輯、腫瘤免疫治療等技術風靡全球生物醫藥市場的今天，小分子藥物一下子變得不太受醫藥界和投資圈待見了，然而最近的蛋白降解靶向嵌合體技術——PROTAC（PROteolysis TArgeting Chimera，一種雙功能小分子，一端結合E3泛素連接酶的配體，另一端結合靶蛋白的配體，在體內小分子可以將將靶蛋白和E3酶拉近通過泛素—蛋白酶體途徑降解）的出現，小分子靶向藥物目最近風頭正盛（基於PROTAC技術，2013年耶魯的Craig Crews教授創辦了公司Arvinas之後，從2015年開始，默沙東、羅氏、輝瑞等製藥巨頭先後投入了十多億美元進行合作開發）。

在細胞體內有多種蛋白降解技術，泛素—蛋白酶體途徑只是一種，對於某些神經退行疾病的關鍵靶蛋白來說PROTAC並不是那麼好用【1,2】（具體有哪些侷限性文末再討論）。而今日Nature在線發表的一項來自復旦大學研究團隊的開創性工作，創造性的地提出利用自噬小體綁定化合物（ATTEC）降解致病蛋白的概念，並通過基於化合物芯片和前沿光學方法的篩選，發現了此類小分子偶聯化合物。它們特異性結合自噬關鍵蛋白LC3及致病蛋白而不結合正常蛋白，將致病物質特異包裹進入自噬小體並降解。

本項目最終實現了對致病變異亨廷頓蛋白的選擇性降解，有望為亨廷頓病的臨床治療帶來新曙光。而基於ATTEC將致病蛋白特異性靶向自噬小體進行降解這一原創概念，可開發針對其它致病蛋白和致病物質的創新藥，具有廣闊的運用前景。

據BioArt瞭解，相關成果已申請多項發明專利，並獲國際著名生物醫藥投資機構的大額投資計劃。

溫馨提示：文末附BioArt獨家披露的論文背後的故事！

亨廷頓病（或稱亨廷頓舞蹈症）位列四大神經退行性疾病之一，臨床表現為不自覺的肌肉抽搐、認知障礙、精神異常等症狀。由於引起該病的變異亨廷頓蛋白（mHTT，Mutant huntingtin protein ）生化活性未知，無法靶向，傳統依靠阻斷劑以阻斷致病蛋白活性的方法並不適用。

2019年10月31日，復旦大學生命科學學院

魯伯壎與丁澦（yù）課題組和復旦大學信息科學與工程學院光科學與工程系費義豔課題等多學科團隊通力合作在Nature雜誌上以長文（Article）形式（BioArt注：本文在Nature沒改版之前是按照編輯部給的Article要求來的，不過現在Nature改版後已不再區分Letter和Article）發表文章“Allele-selective Lowering of Mutant HTT Protein by HTT-LC3 Linker Compounds”，開創性地提出基於自噬小體綁定化合物（ATTEC，Autophagosome Tethering Compounds）的藥物研發原創概念，並巧妙地通過基於化合物芯片和前沿光學方法的篩選，發現了特異性降低亨廷頓病致病蛋白的小分子化合物，有望為亨廷頓病的臨床治療帶來新曙光。

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開闢新思路：“小分子膠水”助力細胞自噬“吞沒”致病蛋白

既然運用阻斷劑阻斷或抑制致病蛋白的傳統道路行不通，團隊另闢蹊徑，著眼於駕馭細胞自噬這一細胞內蛋白降解途徑以有效降低變異亨廷頓蛋白水平。在自噬過程中，關鍵蛋白LC3被脂化後聚合擴增，形成膜結構，並將蛋白、脂類、細胞器等降解目標包裹於其中，形成完整的自噬小體（autophagosome），與溶酶體融合後，其中包裹的物質得以降解。

然而，自噬的降解功能強大，若自噬功能整體增強而缺乏特異性，會降解所有包裹進自噬小體的蛋白，這樣一來，承擔著神經保護功能的正常野生型亨廷頓蛋白以及其它發揮重要功能的蛋白也易被“誤吞”。傷敵一千，卻自損八百，並非理想之策。

如何在排除野生型亨廷頓蛋白的情況下，特異性地綁定致病蛋白進入自噬小體？團隊設想發明一種小分子綁定化合物

ATTEC （Autophagosome Tethering Compounds），或稱之為“小分子膠水”，能夠直瞄靶心，牢牢地將LC3及致病蛋白（或其他致病物質）黏在一起，進而將致病蛋白包裹進入自噬小體進行降解。同時，“小分子膠水”並不黏附野生型亨廷頓蛋白，使其得以安然無恙。經過篩選、純化及系列細胞實驗後，團隊共獲四個符合要求的理想化合物。

至此，研究所得分子已具備滿足理想條件的理論可行性，而是否可適用於動物細胞和人體細胞，通過給藥達到預期功效，則需進一步研究驗證。

團隊發現，這四個化合物在小鼠神經元、亨廷頓病病人細胞以及亨廷頓病果蠅模型中，均可顯著降低變異亨廷頓蛋白水平，而對野生型亨廷頓蛋白水平幾乎沒有影響，且起效濃度在納摩爾級別（~10 nM）。

更令團隊感到驚喜的是，“這四種化合物中有至少兩種，可以跨過血腦屏障，並通過低劑量腹腔給藥直接降低亨廷頓病小鼠的大腦皮層及紋狀體的變異亨廷頓蛋白水平，而不影響腦組織中的野生型亨廷頓蛋白水平，也改善了疾病相關的表型，為亨廷頓病口服或注射藥物的研發提供了切入點。”魯伯壎介紹道。

圖為魯伯壎教授今年5月份在BioArt共同組織的神經退行性疾病閉門會議（2019年（第一屆）神經退行性疾病研究前沿論壇成功召開）上對該工作進行詳細介紹。

學科新交叉：小分子芯片和光學檢測技術實現高通量篩選

事實上，此類“小分子膠水”並不好找。若逐一對數千種化合物進行細胞分析檢驗，以從中甄別出符合理想性狀的幾種目標分子，無疑如大海撈針，這也一度成為團隊研究道路上的一大障礙。

而復旦信息科學與工程學院光科學與工程系費義豔課題組的加盟則為“小分子膠水”的發現帶來了新的可能。該課題組發展了基於小分子芯片（Small Molecule Microarray, SMM）和免標記斜入射光反射差（Oblique-Incidence Reflectivity Difference, OI-RD）技術的新型高通量藥物篩選平臺，能夠快速、靈敏、無標記地從成千上萬種小分子化合物中找到與靶標蛋白結合的小分子。

課題組將近四千種小分子化合物點樣於芯片上，當靶標蛋白流過時，若它能夠與固定在芯片上的特定小分子結合，則該位置的分子層厚度增加，這一微小變化即可被光學方法（斜入射光反射差技術）靈敏檢測。採用這種新型的藥物篩選方法，課題組共找到兩種小分子，它們既能夠與LC3蛋白結合，也能夠與變異亨廷頓蛋白結合，但不與野生型亨廷頓蛋白結合。通過對具有類似結構的小分子化合物的檢測，共獲得四種可綁定LC3與變異亨廷頓蛋白的“小分子膠水”。

應用新前景：自噬小體綁定化合物打造藥物研發新概念

團隊決定打破砂鍋問到底，進一步探究這些小分子化合物能夠區分變異亨廷頓蛋白與野生型亨廷頓蛋白的內在機制。變異亨廷頓蛋白和正常蛋白結構基本無異，唯一的差別就在於變異蛋白含有過長的谷氨醯胺重複（polyQ）。而這些化合物之所以能夠“明辨忠奸”，正是因為其可選擇性地結合變異亨廷頓蛋白所特有的過長polyQ區域，根據這一特性對兩者予以區分。

依據這一特性，團隊意識到這些小分子化合物的用武之地也許遠不止亨廷頓病這一種疾病。目前已知有九種polyQ疾病，都是由特定的含有過長polyQ的突變蛋白所導致。脊髓小腦性共濟失調III型疾病就是一例，它是中國人群中發病率最高的polyQ疾病，臨床表現為運動的協調障礙、無法維持軀體姿勢和平衡等，可伴有突眼、腱反射亢進、面肌顫搐、肌痙攣等症狀。團隊利用復旦大學附屬華山醫院教授王堅課題組孫一忞醫生提供的共濟失調III型病人細胞進行了檢測，發現這些化合物均可以有效降低引起該病的變異蛋白（polyQ長度為74）水平，而不影響其野生型蛋白水平（polyQ長度為27）。

“這些化合物不僅可能對亨廷頓病的治療有效，也可能運用於其它polyQ疾病；自噬小體綁定化合物（ATTEC）這一藥物研發新概念，也有望應用於其它無法靶向的致病蛋白，甚至非蛋白的致病物質。”談及成果未來應用前景，魯伯壎充滿期待。

神經退行性疾病領域著名科學家

Huda Zoghbi（美國科學院院士、HHMI研究員、2017年科學突破獎（breakthrough prizes）獲得者，詳見此前BioArt的報道：2017年度生命科學突破獎揭曉）為該研究撰寫了專文評論同步發表於Nature，高度評價推薦了此項研究，同時為未來的努力方向提供了很好的建議：“在小鼠模型中長時程的臨床前研究是確定長期治療療效的持續性和可靠性所必須的”。

據悉，魯伯壎、費義豔和丁澦為該論文通訊作者，復旦大學博士生李朝陽、王岑、王紫英和朱成鋼為第一作者。

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論文背後的故事

魯伯壎

1. 早在2012年就有這個想法，但是用我當時已知的技術做光篩選要投入幾百萬經費和很多人力，不知道能不能篩出來，不太敢做。後面青年教師俱樂部晚餐的時候瞭解了光科系費義豔老師的工作，有很好的方法，才得以實行。後來蛋白質生化方面有很多地方沒有經驗，機緣巧合下學院安排丁澦老師幫助我的工作，一下就推進起來了。

2. 開始篩選出兩個化合物後檢測效果並不好，重複過很多次準備放棄了。有次食堂聊天時受啟發突然想到，我們一直按之前的經驗主要較高濃度（10uM），而按照我們預測的“膠水”，可能在較高濃度下不起作用，因為膠水分子會分別跟兩種蛋白結合，而不會把它們拉倒一起去。只有最合適的濃度，才會起比較好的效果。所以回去檢測nM級別的各個濃度，就看到了效果。

3. 在尋找化合物與變異HTT蛋白結合位點時，我根據已有的基於領域已有權威文獻提出了一個我認為很有可能的假說，即化合物識別了N17和Proline-rich domain的interface。按著這個假說，我設計了一套基於FRET的檢測方法，讓一個博士生和一個本科生做了很久，但是結果跟原本的假說越做越不符合。而那期間，我們的另一個項目則取得進展，提示了我另一種可能，即化合物識別的擴增polyQ的新浮現的特殊構象。一試之下果然如此，而且一下把藥物的用途拓展到了別的polyQ疾病。

4. 文章數據基本在2018年9月就完成了，我給Nature和Cell投了Presubmission，很快都回信說感興趣，邀請我投全文。其中Nature的編輯回信很長很認真，感覺是不是興趣更大，所以後面投了Nature。中間還有個插曲，收到Presubmission回覆當天還挺高興的，結果反而不小心摔骨折了，而且骨折的是右臂，所以右手幾個月不能動，工作和生活都靠左手，一直到2018年底才開始忍痛雙手開工寫文章，最後2月初投稿。

5. 投稿後一審意見很不錯，不過還是有蠻多要補的實驗。我們安排了五個參與實驗室同時開始全力補實驗，不到兩個月就完成了。

6. 稿件接收後得知Huda Zoghbi院士會寫News and Views評論，寫信給她表示感謝，她回答說“It is really a beautiful study and I hope it can translate nicely. ”，並且給了很好的進一步研究的建議。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1722-1

參考文獻

1、Winter, G. E. et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.Science 348, 1376–1381 (2015).

2、 Lu, K., den Brave, F. & Jentsch, S. Pathway choice between proteasomal and autophagic degradation. Autophagy 13, 1799–1800 (2017)

製版人：小嫻子