神經科學重磅突破：無需光纖植入的“經顱光遺傳學”來了

紫紅質通道蛋白（channelrhodopsins ,ChRs）是在能進行光合作用的藻類中發現的光門控離子通道蛋白。在大腦中轉基因表達ChRs使得靠光就能激活神經元。這些通道蛋白在神經科學研究中被廣泛應用。然而，現有ChRs的侷限性阻礙了許多光遺傳的應用。

例如，ChRs在可見光區有較寬的激活光譜並且需要較高強度的光激活(~1mW mm^-2)。由於ChRs是天然的低導通道，需要在神經元的質膜中表達10⁵-10⁶個功能性ChRs，才能介導足夠的光依賴性去極化和誘導神經元激活；在老鼠腦中，激活ChRs需要距目標細胞群100μm以內發射1-15 mW光以確保引起動作電位，這限制了光依賴激活腦組織的體積(~1 mm³)。在不需要植入侵入性光纖進行光傳輸的情況下，發明高光敏感度和高光電流的光遺傳離子通道蛋白以激活更大容量的腦組織迫在眉睫。

2019年10月14日，加州理工學院Viviana Gradinarua和Frances H. Arnold實驗室在Nature Methods雜誌上發表了題為Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics的論文。文章運用了機器學習的方法，即利用大量的ChR變異體文獻，為設計高性能的ChRs訓練統計模型。

在有限的102個有功能特性的ChRs實驗組訓練高斯過程模型，設計了高光敏度和高光電流的ChRs。其中三個突變體，即ChRger1-3，在無光纖植入的情況下，光誘導即可使神經元興奮，也就是說，

光遺傳學研究離不開病毒，病毒可將表達光敏感通道蛋白的DNA傳送到神經細胞中，大部分實驗依賴於侵入性的顱內病毒傳遞，而通過尾靜脈注射病毒進而特異感染神經細胞起到傳遞目的基因的方法在傳統光遺傳學中應用甚少，因為全身性注射病毒，神經細胞感染病毒量較少，表達ChR2的量不足以介導光依賴性去極化產生動作電位。

ChRger1-3高光敏度和高光電流，少量表達就足以介導光依賴性的動作電位。以下實驗結果便是作者使用全身性傳遞特異感染神經系統的病毒（病毒外殼蛋白是rAAV-PHP.eB）的方式驗證ChRger1-3的特性。

作者使用了光遺傳學顱內自刺激腹側被蓋區(VTA)多巴胺能神經元的行為學範式來評估ChRger2的光遺傳效率。作者將rAAV-PHP.eB包裝的雙flox包含ChRger2或ChR2 (H134R)的倒開放閱讀框的病毒全身注射到Dat-Cre老鼠(圖a和b)。

3周後立體定位植入光纖套管到腹側被蓋區上方，把老鼠放在一個自刺激操作盒，條件性誘導使它們通過鼻子觸發447nm激光。表達ChRger2的動物以頻率依賴和激光功率依賴的方式表現出強健的光遺傳自我刺激。激光頻率越高(高達20hz)和功率越高(高達10mw)則促進更大的操作響應率(圖c)。相反，激光刺激不能增強表達ChR2(H134R)的動物的操作反應(圖c)。

這些結果與急性切片的結果一致，在急性切片中，ChR2(H134R)的光誘導電流較弱，由於其全身性注射病毒，ChR2低拷貝數不足以介導光依賴性去極化產生動作電位。

為了確定ChRger2是否能夠同時實現微創轉基因傳遞和微創光激發，作者用rAAV-PHP.eB 包裝CaMKIIa啟動子驅動轉錄的ChRger2或ChR2(H134R)病毒全身性感染小鼠，檢測皮質興奮性錐體神經元的轉基因表達(圖d)，接著通過對感染病毒老鼠的右側第二運動皮層(M2)進行無創性光刺激來測試自由運動的動物的運動定向控制。

在實驗中，M2單側刺激可以破壞了對側下肢的運動功能，導致小鼠偏離刺激側。儘管顱蓋骨的存在引起光散射，用20mW447nm的光刺激可使表達ChRger2的動物發生左轉行為，但表達ChR2(H134R)的動物在接受光刺激時則沒有發生左轉行為(圖f)。並且停止光刺激時，發生左轉行為的老鼠停止左轉。即便光強度低至10 mW，小鼠的光刺激誘導左轉行為仍會發生。

為了確保小鼠的轉向行為不是由於視覺刺激或激光引起的熱刺激所致，作者使用671nm的光源重複了實驗，671nm在兩個光敏感蛋白的激發光譜之外。20mw671nm的光不能誘導表達ChRger2和ChR2(H124R)的老鼠轉向(圖g)。總的來說，這些實驗表明，ChRger2可用於全身性基因傳遞，能夠實現微創的光遺傳興奮。

Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics.

作者信息

編譯作者：濟滄海（brainnews創作團隊）

校審：Simon（brainnews編輯部）