非洲豬瘟——臨床診斷檢測

ASF 的準確、快速診斷對於防止 ASF 蔓延、快速撲滅和根除尤其重要。ASFV 自然感染的潛伏期大約為 4—19天 (Wardley et al., 1983),感染後 7-10 天可檢測到抗體。

一個地區或豬場首次暴發 ASF 時呈最急性、急性感染臨床症狀,感染豬隻表現為急性出血、死亡,由於首次暴發時發病豬隻在抗體出現前就已經死亡,此時首選抗原檢測方法。隨著病毒循環和擴散,其毒力會下降,感染豬隻表現

為亞急性和慢性感染臨床症狀 (Bech-Nielsen et al., 1995;

Penrith et al., 2004; Wardley et al., 1983),此時抗體檢測

更適用於疫情的監測和 ASF 根除計劃。

一、臨床診斷

ASF 的臨床症狀和許多其他豬的疾病很相似,特別是豬瘟、豬丹毒和豬高致病性藍耳病等。鑑別診斷依靠病原學或血清學診斷。

ASFV 感染後,發病率一般在 40-85% 之間,死亡率由 ASFV 毒株的毒力決定。高致病性毒株死亡率可高達 90-100%;中致病性毒株在成年動物能引起20-40% 的死亡率,在幼年動物中引起 70-80% 的死亡率;低致病性毒株能夠

造成 10-30% 的死亡率。特急性型 ASF 表現為突然死亡,臨床症狀不明顯。

急性症狀表現為食慾減退、發熱(40-42℃)、肺水腫、淋巴組織廣泛壞死和出血、皮下出血和高死亡率 (Gomez-Villamandos et al., 1995b; Mebus, 1988)。亞急性或慢性感染有時可能會出現鼻出血、便秘、嘔吐,出血性腹瀉。在四肢、耳、胸部、腹部和會陰部位出現不規則的出血斑,這些症狀在感染中等致病毒株的豬中較為明顯。

非洲豬瘟——臨床診斷檢測

全身臟器出血、壞死是 ASF 的主要臨床表現,具體表現為皮下出血,淋巴結廣泛出血和壞死,嚴重時呈黑色。肺水腫。脾臟腫大、質脆變脆,腎臟、腸繫膜和漿膜出血

非洲豬瘟——臨床診斷檢測

非洲豬瘟——臨床診斷檢測

二、病原學診斷

病原學診斷依賴於活病毒、抗原、基因組的檢測,

包括病毒分離、抗原 ELISA、熒光抗體檢測(FAT)、

PCR 和 等 溫 擴 增 分 析 等 方 法。 目 前 實 時 熒 光 定 量

qPCR(Quantitative real-time PCR,qPCR) 使用最為廣泛,

對 ASFV 診斷具有很高的靈敏性和特異性。

ASFV 主要在網狀內皮系統的細胞內複製。可採集的臨床樣品包括抗凝血(EDTA)、脾臟、肝臟、淋巴結和扁桃體 (PJ, 1989)。若需病毒分離,樣品運送過程中需保持

低溫冷藏,不能冷凍。

1、病毒分離

ASFV 可以從血液、脾臟、肝臟、淋巴結和扁桃體等組織中分離。紅細胞吸附(HAD)實驗可用於ASFV檢測。但是後來發現部分 ASFV 毒株呈現 HAD 陰性。

非洲豬瘟——臨床診斷檢測

2、熒光抗體檢測(FAT)

用疑似感染 ASF 的豬組織製作塗片或冰凍切片,內源性的抗原可與特異性的 AFSV 熒光抗體結合,顯微鏡直接觀察結果。優點是快速、特異高,對於急性病例的診斷靈敏度較高,但對亞急性或慢性 AFS,由於自身抗體會阻斷熒光抗體與抗原的結合,容易出現假陰性結果。

3、抗原 ELISA

病毒抗原也可用 ELISA 檢測,但只推薦在急性病

例時使用,靈敏度沒有 PCR 檢測方法高 (Steiger et al.,

1992)。第一個直接 ELISA 檢測 ASFV 的方法能檢測的抗原

濃度是 50-500 HAD50/ml (Wardley et al., 1979)。後來基

於 VP72 單抗的雙抗夾心法 ELISA 具有較高的靈敏性 (Vidal

et al., 1997)。

目前 qPCR 被認為是 ASFV 基因檢測的金標準,被用在 OIE 所有的區域性參考實驗室。血液、血清和組織樣本都可用於qPCR檢測。優點是快速、敏感性和特異性都很高。能夠檢測出所有 ASFV 毒株(23 個基因型),甚至因保存不當而降解的樣本也可用於檢測 (Boshoff et al., 2007)。但容易因交叉汙染出現假陽性的結果,此外,因 PCR 抑制物及核酸降解出現的假陰性也應該注意。

King 首次報道 TaqMan 探針熒光定量 PCR 檢測方

法 (King et al., 2003),該方法在 OIE 推薦方法,引物針

對 VP72 保守區域,有很高的特異性和靈敏度,針對 25 種

ASFV 毒株和 16 種非洲及歐洲的軟蜱 ASFV 毒株,靈敏度

達到 10-100 個核酸分子。

三、血清學診斷

豬感染 ASFV 後 7-10 天可出現抗體,抗體可以持續

很長時間,由於目前沒有 ASF 疫苗可用,因此抗體檢測可

作為感染 ASFV 的診斷依據,尤其是針對於亞急性和慢性

ASF,適合大規模抗體篩查。在 ASF 根除計劃中有很重要

的作用。

ASFV 編碼多種蛋白,具有診斷意義的蛋白主要有

p72,p54, p30(p32) 和 p62 蛋白。常用抗體檢測方法主要

有ELISA,間接免疫熒光實驗(IIF)、對流免疫電泳(IEOP)

和免疫印跡 (IB) 等。

最早用於ASF抗體檢測的是對流免疫電泳(IEOP)(Pan

et al., 1972),後來被敏感性更高的 ELISA 取代,國際間貿易

多用 ELISA 檢測。鑑於 ELISA 檢測容易出現假陽性結果,陽

性樣本需要再次進行 IIF 或 IB 檢測確認。IB 可對結果作出一

個簡單客觀的解釋 (Alcaraz et al., 1990; Pastor et al., 1989)。

非洲豬瘟——臨床診斷檢測

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